流式操作时需要的最低细胞量

chujindong

最近做流式检测T细胞亚群的数量比例，因为测的指标多，可能存在细胞量不足的问题。按我查的资料来看，对细胞量的要求都不一致，有的要求2*10⁷，有的0.5-1*10⁷，还有人告诉我最少5*10⁵。我还没开始用自己的标本测。不知道大家的经验来看的话最少细胞量多少足够呢？包括标记样本以及空白对照。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-6-18 12:24

                               
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最近做流式检测T细胞亚群的数量比例，因为测的指标多，可能存在细胞量不足的问题。按我查的资料来看，对细 ...

测临床标本的话让他们抽个2ml以上肯定足够用了，不需要这么复杂吧。

chujindong

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倪老师的意思是用全血？我们用的是PBMC，比较麻烦

niwanmao

chujindong 发表于 2011-6-19 09:54

                               
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倪老师的意思是用全血？我们用的是PBMC，比较麻烦

流式表型的检测一般需要的细胞量都差不多，按照我们平时做免疫分型的经验，每管细胞数在1×10E5，孵育抗体的体积在100ul，上机前用PBS把最终体积定在200ul，以免很快取光。

chujindong

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今天常识用全血做，参考了一下ebioscience的protocol。担心细胞少就多加了些全血，先加荧光抗体冰上避光孵育30分钟，再裂解；裂的不好，没继续做下去。因为没做过，对细胞量很不放心。1*10E5的话，细胞应该几乎看不到吧，真不知道做完了细胞还在不在了，说不定哪一步没操作好细胞就没了。准备再摸索一下试试。另外，如果细胞量少的话抗体就可以比说明书少些了吧？

niwanmao

chujindong 发表于 2011-6-20 21:33

                               
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今天常识用全血做，参考了一下ebioscience的protocol。担心细胞少就多加了些全血， ...

你是不是做胞内标记？如果做胞内标记因为洗涤次数较多，可能需要适当增加。如果只是做胞膜的，那么一般只要洗涤1-2次，1×10E5足够了，除非离心机有问题。

chujindong

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谢谢倪老师。我现在做的是表面标记，胞内的也正准备摸索条件。以前没怎么做过，这几天做了一下，发现熟练以后确实不需要很多的细胞。全血的办法我再试试。这个应该是最省细胞的方法了。我听说胞内流式的话最好是用PBMC，不知是不是这样？我看文献做胞内一样可以用全血做的，发的文章也不错。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-6-21 22:04

                               
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谢谢倪老师。我现在做的是表面标记，胞内的也正准备摸索条件。以前没怎么做过，这几 ...

我们现在做的胞内标记都用全血的，从来没用过PBMC，因为提取过程中可能会丢失一些宝贵的细胞。
以前我们用CALTAG（现在被Invitrogen收购了）的破膜剂。
现在因为招标的原因，用了BD的破膜剂，两种破膜剂的用法略有不同，CALTAG我觉得用起来更方便，因为它的B液就直接裂红了。

chujindong

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不知道倪老师用全血同时做表面与胞内标记是怎样做的？我昨天做了一下Th17细胞的，做的不太好。我把我的贴上来吧，因为第一次做，可能很多方面都不太好，请指教。
1.        新鲜肝素抗凝血200微升+10%FBS RPMI 1640培养基 800µL+PMA 3µL+ Ionomycin 1µL+ monensin 0.7µL （6孔板）培养箱中培养4小时
2.        离心，300 x g ，5 minutes，弃上清
3.        室温避光裂红，孵育约10分钟. 离心300g 5分钟，弃上清；PBS重悬，离心300g 5分钟，弃上清
4.        PBS100ul重悬，加表面抗体3µL,室温避光孵育30分钟
5.        PBS重悬，离心300g 5分钟，弃上清，重复一次；
6.        弃去上清，加入FIX/PERM 500ul，室温避光20分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清
7.        加Perm/Wash™ buffer 2ml，室温避光孵育10分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清；
8.        100 µl BD Perm/Wash™ buffer重悬，加胞内抗体3uL，室温避光孵育30分钟；
9.        加Perm/Wash™ buffer 2ml，室温避光孵育10分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清；
10.        500ul PBS重悬
11.        上机

niwanmao

chujindong 发表于 2011-6-25 23:39

                               
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不知道倪老师用全血同时做表面与胞内标记是怎样做的？我昨天做了一下Th17细胞的，做 ...

首先明确的是，胞内破膜之后，FSC和SSC肯定会改变，这是无法改变的现实。

我平时的操作步骤与你略有不同：
1、裂解红细胞放在最后一步（如果用CALTAG的破膜剂，就不需要裂解红细胞了）
2、第6、7、8都是10-15分钟。
3、第9步省略，直接改为洗涤。