7-AAD染色方法

cym

老师好，想请教关于7-AAD染色的几个问题：
1、请问7-AAD的单阳管要用什么方式处理细胞 得到更多的阳性细胞呢？可不可以用甲醇固定30min
2、加入7-AAD的体积是和细胞悬液体积有关还是细胞数量相关呢？
3、加入染料后是在常温还是冰上孵育？说明书上没有写，但平时其他染料大多是在冰上孵育的。

4、可否在做流式分选的时候加入7-AAD排除死细胞呢？这个试剂好像是有细胞毒性的，而分选时间又比较长，这样会不会导致细胞活性下降更厉害，从而影响后续的培养呢？我想分选的是人的外周血
还请老师多多指教！

happyeday

7-AAD的单阳管可以65℃加热来获得死细胞。不同的细胞死亡需要的时间不太一样。一般的细胞30s——1min。我们一般加上稍微等几分钟就可以。直接上机也没有问题，尤其分选，因为前期要上样、圈门什么的都需要时间。随着分选时间延长，死细胞是会多一些，我觉得不一定是7AAD的原因。

cym

happyeday 发表于 2022-3-23 11:06
7-AAD的单阳管可以65℃加热来获得死细胞。不同的细胞死亡需要的时间不太一样。一般的细胞30s——1min。我们 ...

谢谢您的回复！
我这次准备染单阳管的是贴壁的肿瘤细胞，可否用EDTA酶将细胞消化下来呢？不知道这样操作会不会使7-AAD阳性的细胞增加
另外分选的时候您是建议加上7-AAD染料排除死活，这样更有利于后续细胞的培养吗？

happyeday

流式细胞分析的时候都是要悬浮状态，所以贴壁细胞肯定是要消化的，我印象中一般阳性细胞的比例至少要大于5%，消化的时候会有一些细胞死亡，但比例不会太高，所以一般还要加热一下。分选加7AAD更可以保证分选后细胞的活力。