细胞样品的固定问题

ziniu9572 · 发表于 2022-3-30 10:38:38

在上一个帖子问了老师关于自发荧光小鼠的细胞流式分选问题，老师可能回复太多没有看到，因此再开一贴原帖如下https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=9708&page=0#pid54907

不断的优化条件但一直没能得到想要的结果，想请教一下老师几个问题
1，假设我的自发荧光消失是因为细胞状态改变导致的，那我是不是可以尝试使用先固定标本再上机的方法？
2，固定的时候具体应该是用乙醇还是用多聚甲醛？
3，如果我想先固定组织再解离，普通的消化方法可以做到吗？

niwanmao · 发表于 2022-3-31 07:25:58

细胞状态改变，不应该这么容易导致GFP消失的。
不知道你流式样本是如何处理的，理论上荧光显微镜能看到，流式不应该看不到。

固定需多聚甲醛。尽量解离后再固定。

ziniu9572 · 发表于 2022-3-31 08:58:25

本帖最后由 ziniu9572 于 2022-3-31 11:09 编辑

niwanmao 发表于 2022-3-31 07:25
细胞状态改变，不应该这么容易导致GFP消失的。
不知道你流式样本是如何处理的，理论上荧光显微镜能看到，流 ...

我们用的就是这个体系的动物，老师之前发帖有讲过https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5485-1-1.html，我流式上机就是找不到FITC信号，切片能看到

niwanmao · 发表于 2022-3-31 20:00:27

ziniu9572 发表于 2022-3-31 08:58
我们用的就是这个体系的动物，老师之前发帖有讲过https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5485-1-1.html，我 ...

流式样本是如何处理的？

ziniu9572 · 发表于 2022-3-31 20:39:47

本帖最后由 ziniu9572 于 2022-3-31 20:41 编辑

niwanmao 发表于 2022-3-31 20:00
流式样本是如何处理的？

1，小鼠用冰冷的PBS灌注后，直接取材，切碎
2，每个脑子加1ml消化液，(消化液配方:6U/ml 中性蛋白酶 II，20U/ml DNAse I),水浴锅37℃消化30分钟，每隔5min用1ml枪吹打一次，消化结束后立即放入冰上终止消化，
3，过70目细胞筛，然后500g离心
4，30%percoll重悬，随后4℃下800g离心30min去髓鞘，
5，去髓鞘后用HBSS 500g重悬去percoll,加缓冲液上机
整个过程从取材到上机大概是2个小时左右

Climber · 发表于 2022-3-31 21:12:19

问一个题外问题，这种大脑的处理方式最后能得到多少量细胞呢，淋巴细胞占比如何，我目前处理大脑的方法得到的细胞不过0.5M

ziniu9572 · 发表于 2022-3-31 21:28:29

Climber 发表于 2022-3-31 21:12
问一个题外问题，这种大脑的处理方式最后能得到多少量细胞呢，淋巴细胞占比如何，我目前处理大脑的方法得到 ...

你这也太少了，我这个做出来至少是你的十倍以上，淋巴细胞占比我没有染过，因为实验目的不是这个

Climber · 发表于 2022-4-1 10:05:20

ziniu9572 发表于 2022-3-31 21:28
你这也太少了，我这个做出来至少是你的十倍以上，淋巴细胞占比我没有染过，因为实验目的不是这个 ...

那您这样处理之后还留下来哪些类型的细胞呢

liuruiluna · 发表于 2022-4-1 15:34:10

本帖最后由 liuruiluna 于 2022-4-1 15:40 编辑

固定只会让GFP更受影响，是GFP吗？你看看这个信息对你有点帮助没，：用抗GFP抗体，对解离后的样本进行标记，可以把因为样本处理淬灭的GFP再次标记出来，例如这样的 https://www.thermofisher.cn/cn/e ... 98-80?imageId=91909

ziniu9572 · 发表于 2022-4-1 21:33:28

Climber 发表于 2022-4-1 10:05
那您这样处理之后还留下来哪些类型的细胞呢

主要是免疫细胞，内皮细胞，小胶星胶这类

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[功能检测] 细胞样品的固定问题