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[标本处理] 免疫重建后不同时间检测T和NK比例,和前次试验结果有出入

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 楼主| 发表于 2022-4-29 17:28:19 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
求助各位老师:人的PBMC回输到免疫缺陷的小鼠体内,我们之前做了一次试验,分别在D7、D10、D14检测小鼠外周血中人CD45、CD8、CD56、CD16的比例,CD45比例逐渐升高,后面我们又重复了一次,在D7、D12检测CD45比例,但是这次我做完以后发现CD45并没有升高,如下图。我是个小白,没接触过流式,所以流式操作以及设门方式都是请教别人做的,但他们也不是很懂,所以想问问各位老师,我这个是什么情况呢?哪里需要改正?流式操作如下:

(1)外周血样品处理
1)将约100 μL小鼠抗凝血样转移到流式管中,加入1 mL 红细胞裂解液,涡旋5秒后室温裂红;
2)10分钟后,350g/5min离心,弃上清液;
3)加入1 mL红细胞裂解液,轻缓吹打均匀,室温放置;
4)5分钟后,350g/5 min离心,弃上清液;
5)加入1 mL 无菌D - PBS重悬细胞;
6)300g/5min离心,弃上清液;
(2)流式抗体染色
每50 μL样品中加入:2 μL hCD45+、2 μL hCD8+、2 μL hCD56+、2 μL hCD16+,4℃孵育15min后,加入1 mL无菌D - PBS,350g/5min离心,弃上清;用300 μL无菌D - PBS重悬样品,转移到流式管中上机进行流式检测。

试验一D7

试验一D7

试验一D14

试验一D14

试验二D7

试验二D7

试验二D12

试验二D12
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发表于 2022-4-29 18:17:25 | 显示全部楼层
将淋巴门去掉直接圈CD45+的话,结果是否一致?
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 楼主| 发表于 2022-5-1 19:54:09 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-4-29 18:17
将淋巴门去掉直接圈CD45+的话,结果是否一致?

我们这边试了一下,细胞数 在D12还是比D7少的多,D20的数据来看,有小部分小鼠CD45比例是在升高的,有很大部分小鼠CD45比例是没有变化,所以我现在是怀疑有部分没重建起来,不知道老师您看我的操作这块有没有问题
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发表于 2022-5-2 20:06:49 | 显示全部楼层
卷卷儿梨 发表于 2022-5-1 19:54
我们这边试了一下,细胞数 在D12还是比D7少的多,D20的数据来看,有小部分小鼠CD45比例是在升高的,有很 ...

操作看不出明显大问题。可能是没有重建好。
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 楼主| 发表于 2022-5-10 13:53:30 | 显示全部楼层
我们又询问了做免疫重建很有经验的老师,确实是会出现这种现象的,谢谢老师的耐心解答~
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发表于 2022-5-11 12:54:11 | 显示全部楼层
想问下楼主,用的是什么品种的免疫缺陷小鼠呀?
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 楼主| 发表于 6 天前 | 显示全部楼层
不停 发表于 2022-5-11 12:54
想问下楼主,用的是什么品种的免疫缺陷小鼠呀?

百奥的B-NDG B2m KO plus mice,不过用已经筛好的Donor回输后体重下降很多,我们也试了集萃的NCG B2m KO小鼠,体重要好很多,供参考
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