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[其它] 巨噬细胞流式分型

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 楼主| 发表于 2022-5-5 15:40:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 limao 于 2022-5-5 15:50 编辑

本人在做诱导巨噬细胞RAW向M1型的造模,用LPS诱导后通过流式检测CD80的表达(FITC单染)。刚接触流式,有几个问题想请教一下。

图片1.png
1.增益问题。
仪器为贝克曼cytoflex, 培训时仪器负责老师说增益要调到20以上,阴性细胞群调到10^2到10^3之间,结果会比较准确。但是我的巨噬细胞blank组(没有加抗体和任何处理)在增益是1的时候他的荧光强度就已经在10^2到10^3之间了,甚至超出了10^3,这个时候我应该调增益到多少呢?是1还是20以上呢?没有加抗体也有这么强的信号是正常的吗?
2. 圈门问题
我的细胞是纯的RAW,是应该圈一个细胞集中的区域还是分析所有的细胞呢?FSC-SSC图感觉可以分为三个群,这个细胞细胞体积很小,是应该圈P1和P2吗?但是细胞极化后体积会不会变大,然后变到P3门里呢?而且随着细胞体积变大他的荧光信号也会变强,可是我没有加荧光抗体呀
3. 巨噬细胞极化问题
用LPS刺激后与对照组比荧光强度没有任何变化,不知道是不是要与IFN-γ联用呢?染色步骤为PBS洗涤后用BSA封闭半小时,1毫升一抗(1:800稀释)孵育30min-1h,PBS 洗涤后1毫升二抗(1:800)孵育30min-1h,洗涤后上机检测,这个时间跨度会造成细胞大量死亡吗?有做这方面的同学也请不吝赐教,谢谢!
图片2.png

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发表于 2022-5-5 19:45:56 | 显示全部楼层
1、增益没有硬性要求,仪器负责人的说法,主要是针对他平时测的细胞,并且主要是指荧光参数,而你这里关注的是FSC和SSC,这个参数并不要求必须在20以上,而是根据细胞大小而定。
2、圈门,建议P2+P3。
3、你用的是不是流式抗体?此外,从来没见过用1ml的染色体积,所以问题出在你的染色上面。
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 楼主| 发表于 2022-5-6 14:08:47 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-5-5 19:45
1、增益没有硬性要求,仪器负责人的说法,主要是针对他平时测的细胞,并且主要是指荧光参数,而你这里关注 ...

谢谢倪老师!说明书上写的可以用于流式,免疫荧光,WB等检测,推荐稀释比例是1:200-1:1000,我就取了1微升的抗体加到了1毫升的PBS里,重悬细胞4度孵育半小时,请问是体积太多了吗?
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发表于 2022-5-6 18:26:36 | 显示全部楼层
limao 发表于 2022-5-6 14:08
谢谢倪老师!说明书上写的可以用于流式,免疫荧光,WB等检测,推荐稀释比例是1:200-1:1000,我就取了1微 ...

体积太大了,这上面说的稀释比例,大多是针对Western blot的。你得尽量按照1:200甚至更高的浓度来做,5~20ul,做一个梯度滴定,确认最佳浓度,染色总体积保持在100ul。
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 楼主| 发表于 2022-5-7 13:43:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-5-6 18:26
体积太大了,这上面说的稀释比例,大多是针对Western blot的。你得尽量按照1:200甚至更高的浓度来做,5~2 ...

好的,谢谢老师解答
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