请教微藻细胞计数和染色的一些问题

Andy学ls

请教大家一些流式微藻细胞计数和染色的问题，设备是BD Accuri C6 Plus
1、阈值的设定为什么会影响藻细胞的计数？不进行任何染色处理，根据藻细胞的自发荧光来表征，是通过PerCP通道的藻红蛋白荧光信号峰来圈门的。FSC/SSC取的是对数，因为用线性分得不是很开，经对数变换后，藻细胞群的横坐标（FSC-H）大约在10E+06，当阈值（FSC-H）设定为2000时，藻细胞数量为30000个/8μL；当设定为200时，藻细胞数量为30000个/25μL，只不过是调低了阈值，藻细胞浓度显著下降了？查阅说明书后发现仪器要求每秒的事件数需要控制在10000以内，最好是2500个以内以提高分辨率，回看自己的数据，阈值为200时可以飙到20000+Events/Sec，此时就算是只跑纯净水也有很多杂质，2000也有将近16000~17000+Events/Sec，所以是因为超过了仪器的检测限而导致测出来的藻细胞数目不一致吗？

2、如果用SYBR Green I 染色还需不需要遵循上述原则即选定一个合理阈值使颗粒数保持在10000甚至是2500以内？

希望各路大神能在百忙之中抽出时间为我解答问题！谢谢！辛苦大家了！

bslhk

这个计数是不准确的，这个仪器想要计数需要借助绝对计数微球。

niwanmao

如果纯净水有大量杂质信号，说明液路本身就不干净，此时的仪器状态就属于不正常，此时做任何实验，都容易出问题。

在仪器维护好之后，再做计数，阈值一般不影响，除非获取的信号数超出了仪器能处理的范围。

Andy学ls

bslhk 发表于 2022-5-25 09:27
这个计数是不准确的，这个仪器想要计数需要借助绝对计数微球。

可官网介绍说无需添加计数微球 可按直接体积计算细胞浓度？

Andy学ls

niwanmao 发表于 2022-5-25 13:05
如果纯净水有大量杂质信号，说明液路本身就不干净，此时的仪器状态就属于不正常，此时做任何实验，都容易出 ...

倪老师 会不会是我的阈值设太低了 检测到的大量杂质信号其实是纯净水中本身就存在的纳米级直径的颗粒物而非液路本身不干净？
不过获取的信号数确实一直都是超越了仪器处理范围的 目前考虑在调高阈值的基础上进行稀释

niwanmao

Andy学ls 发表于 2022-5-26 11:00
倪老师 会不会是我的阈值设太低了 检测到的大量杂质信号其实是纯净水中本身就存在的纳米级直径的颗粒物而 ...

如果是体积法的仪器，可以直接计数，但是液路保持干净很重要，否则不仅仅阈值超出，而且体积也容易不准。