电压补偿调节

Fairy

请问各位老师，我做的药物对癌细胞的凋亡作用，用FITC和PI单染调的补偿，为什么感觉结果怪怪的，细胞没有分开的感觉。刚开始做请各位老师多多指导。以下是我做出来的图

niwanmao

FITC那管过度补偿，其它几个基本可以。

Fairy

好的，谢谢老师，请问老师给药组的细胞感觉没有分开正常吗，一般情况感觉凋亡细胞和正常细胞会分的很开，我的这个感觉有些黏连，是因为补偿没有调节好的原因呢还是其他原因呢？

niwanmao

Fairy 发表于 2022-6-4 13:26
好的，谢谢老师，请问老师给药组的细胞感觉没有分开正常吗，一般情况感觉凋亡细胞和正常细胞会分的很开，我 ...

补偿没有调到位是一个因素，另一个因素与药物、细胞种类、作用时间均有关。

Fairy

好的谢谢老师

wxd

除了补偿没调好之外，可能跟你的画门方式也有关系。细胞凋亡的门不是严格按照Blank在FITC和PE通道的上限进行画门的。根据实际情况，十字门位置可能会有偏移，比如图1。从这一点上看，你放的那张文献上的图片，十字门的位置其实是不严谨的。另外，PE通道的补偿不好调节的话，可以尝试用PerCP通道，效果会好很多。

Fairy

wxd 发表于 2022-6-7 10:42
除了补偿没调好之外，可能跟你的画门方式也有关系。细胞凋亡的门不是严格按照Blank在FITC和PE通道的上限进 ...

好的谢谢老师 我下来试试。做的几次也都很奇怪，统一的是FITC的补偿比较难调节，但PI就很好，几乎不用怎么调整

Fairy

wxd 发表于 2022-6-7 10:42
除了补偿没调好之外，可能跟你的画门方式也有关系。细胞凋亡的门不是严格按照Blank在FITC和PE通道的上限进 ...

老师请问门的偏移是调节补偿后根据情况再调整空白的门，让门适应这三者对嘛?如果这样考虑那根据前面帖子里的FITC和PI中的细胞团没有像老师您的分的这么开该如何调整呢？好像PI有分团，但是FITC就是一簇。单染的都是阳性对照

wxd

凋亡的十字门正常情况下是这样的， 先根据Annexin V-FITC上的细胞分团，画十字门，重点确认那条竖线的位置，然后将门应用的PI单阳管，调整横线的位置，然后应用到空白管，确认空白管细胞在左下角那个象限，然后将门应用到所有组别，逐个查看十字门是不是明显穿过了某个细胞团，如果是，以这个组为准调整十字门，再应用到其他组别，逐个查看。至于单染的阳性对照，我们不是单独取正常的细胞诱导凋亡，而是从各个实验组分别取一部分，混匀之后分成三份，分别标记Blank、FITC和PI，然后染色。这样这三管细胞就可以基本代表这一组实验整体的细胞状况。至于你的FITC是一簇，没有阳性群，有可能是电压或者补偿没有调节好。PE通道的电压可能偏高，导致FITC漏到PE通道的荧光干扰比较大，可以尝试降低一下PE通道的电压。如果流式细胞仪有PerCP通道的话，可以用PerCP通道检测PI的荧光，补偿非常好调节。

范晋波

Annexin v  背景干扰比较强，不需要Blank，blank主要用来调整FSC和SSC和大致的FITC PE  Percp电压即可，而且前侧向阈值要适当的调小一点，因为凋亡的细胞物理形态，所以阈值很容易切掉