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凋亡检测中出现这个问题，可以先看一下正常培养的对照组细胞是不是也是这样，如果是的话，说明在细胞消化、清洗和染色过程中细胞破碎了。要避免这种情况，需要从这三方面入手。首先细胞消化，加入胰酶后，要时刻注意细胞形态的变化，避免过度消化，遇到特别难以消化的细胞，可以先将细胞放到4℃冰箱一段时间以降低细胞贴壁能力或胰酶配合10 mM EDTA进行消化。需要注意的是，如果额外加入了EDTA，消化后的细胞，需要使用无血清培养基多次清洗以避免EDTA对后续染色造成影响。清洗过程中，注意避免离心转速过高，一般细胞的离心转速不超过300g，细胞越大越脆弱，离心转速越低。另外，在不影响染色的情况下，清洗步骤越少越好，可以通过增大清洗液体积的方式以更少的清洗次数达到同样的清洗效果，比如用1 mL PBS重悬细胞，需要清洗2次。用5 mL PBS重悬细胞，清洗一次可能就可以了。还有染色，染色前确认流式细胞仪可用再染色，避免染色完成后再去开仪器。染色步骤按照说明书进行，不同品牌的凋亡试剂盒，染色条件可能会有细微差异，比如贝博生物的凋亡检测试剂盒的染色是冰上避光孵育的，但是碧云天的是室温避光孵育的，这些也是需要注意的。 |
发表于 2022-6-4 19:26:14
发表于 2022-6-4 19:37:37
