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[标本处理] 巨噬细胞加完抗体后消失了

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发表于 2022-6-24 18:24:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
小鼠脾来源的巨噬细胞染色,所有染色管包括单标管的FSC-SSC上都没有巨噬细胞群,但是空白管的有。
耗材和抗体都是之前用过的,第一次做出来效果还不错,但是今天完全没有巨细细胞群,想请问各位老师可能是什么原因。

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发表于 2022-6-24 19:41:51 | 显示全部楼层
是否后面获取其它管的时候,由于团块堵塞了液路,造成未获取到细胞?
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 楼主| 发表于 2022-6-24 21:32:18 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-6-24 19:41
是否后面获取其它管的时候,由于团块堵塞了液路,造成未获取到细胞?

倪老师你好,由于不是本人上机的所以不是很清楚上机时的状况。

但是虽然没有巨噬细胞,其他管还是可以看得到碎片和单核细胞(FSC 50K左右有一群),现在唯独只有空白管观察到了巨噬细胞(FSC 100K-150K之间),而且即使是和空白管同一来源的其他管都没有观察到。

之前有思考是不是加抗体吹打或者涡旋造成了细胞损伤,但是我感觉10微枪头吹打和1~2秒的涡旋应该不会对巨噬细胞产生如此大的影响,不知道是否还有其他原因。
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发表于 2022-6-25 07:50:34 | 显示全部楼层
薄乐 发表于 2022-6-24 21:32
倪老师你好,由于不是本人上机的所以不是很清楚上机时的状况。

但是虽然没有巨噬细胞,其他管还是可以看 ...

如果是操作造成的,感觉不应该这么巧,只出现在染色管。

你观察一下Time参数的图上,信号稳定性如何?
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 楼主| 发表于 2022-6-25 11:57:24 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-6-25 07:50
如果是操作造成的,感觉不应该这么巧,只出现在染色管。

你观察一下Time参数的图上,信号稳定性如何? ...

Time-FSC图上连续性良好,虽然部分管有一些断裂带,但是之后也是均匀分布的信号,似乎没有特别的形态
设置了读到目标数量终止,所以很多管time在10~20期间就终止了。

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发表于 2022-6-25 14:16:46 | 显示全部楼层
薄乐 发表于 2022-6-25 11:57
Time-FSC图上连续性良好,虽然部分管有一些断裂带,但是之后也是均匀分布的信号,似乎没有特别的形态
设置 ...

所有管的获取数量也是一致?如果有可能的话,将FCS打个包传上来,可以从获取的数据里面再找找原因。
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 楼主| 发表于 2022-6-27 11:23:18 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-6-25 14:16
所有管的获取数量也是一致?如果有可能的话,将FCS打个包传上来,可以从获取的数据里面再找找原因。 ...

管内的原始数量在2-4*10^5个细胞,上机时统一设置为读取15000个。
我看了下FCS里记录的上机时间,空白管是最后一个上机的,所以应该也不会是堵塞管路的原因。

打包数据这个有难度,倪老师可以说几种可能性比较大的原因么,非常感谢。
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发表于 2022-6-27 12:06:25 | 显示全部楼层
薄乐 发表于 2022-6-27 11:23
管内的原始数量在2-4*10^5个细胞,上机时统一设置为读取15000个。
我看了下FCS里记录的上机时间,空白管 ...

所有文件确实都存在15000个细胞吗?如果是的话,你确认一下不同管的15000个信号分别是什么?如果是因为大量碎片和非特异信号占据了该管,那么可能是获取时的液流发生了异常。
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 楼主| 发表于 2022-6-27 13:12:16 | 显示全部楼层
本帖最后由 薄乐 于 2022-6-27 15:51 编辑
niwanmao 发表于 2022-6-27 12:06
所有文件确实都存在15000个细胞吗?如果是的话,你确认一下不同管的15000个信号分别是什么?如果是因为大 ...

是的,只有2管没能收到15000个细胞,稍微圈了一下碎片大概在30-40%。
少数管在碎片的附近就有一个群,有没有可能是加完抗体后细胞都缩小了,导致FSC上他们都挤在了左下角没法很好地分散开(FSC直方图:碎片0~15k有一峰,15k-35k有一峰,35k-60k有一峰)?但如果是这个原因的话,可能是缓冲体系出问题么?但如果是缓冲体系的问题,我又无法解释空白管为什么又可以很好地分开。如果提高读取数量可能能改善么?老师一般都要求我们读10000个,这次15000已经是提升了很多了。

Snipaste_2022-06-27_12-58-11.png (42.71 KB, 下载次数: 0) Snipaste_2022-06-27_13-02-53.png (37.48 KB, 下载次数: 0)
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发表于 2022-6-27 16:40:18 | 显示全部楼层
薄乐 发表于 2022-6-27 13:12
是的,只有2管没能收到15000个细胞,稍微圈了一下碎片大概在30-40%。
少数管在碎片的附近就有一个群,有没 ...

空白管同样这两个图的图形是咋样的?
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