查看: 404|回复: 14
收起左侧

[试剂耗材] Isotype的荧光值反而高?

[复制链接]
 楼主| 发表于 2022-6-29 16:20:03 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
记得之前有帖子倪老师提到过在目标抗原微弱表达的时候,isotype的荧光值可能会比待测样本还高,造成无法划门。今天自己做流式就遇见了。


红色是Isotype,蓝色是待测的FAP。

FAP的表达应该是很低,或者几乎没有,所以出现这样的结果并不是太意外。
但是Isotype的荧光值似乎高的太多了,这样正常吗?(应该是没有加反试剂)

如果荧光值差不多,或者高一点我觉得应该是正常的,这样Isotype反而高4-5倍的情况有吗?
虽然听说过Isotype反而高的这种情况,但是自己没遇见过。第一次遇见就高这么多,不知道还算正常吗?大家都遇见过什么情况呢?

红色Isotype 蓝色FAP

红色Isotype 蓝色FAP
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2022-6-29 19:47:03 | 显示全部楼层
isotype不太容易匹配。
如果确保是匹配的,那么FAP应该是胞内标记吧,试一下破膜后,洗涤后Fc阻断,然后再洗涤,接着进行两者染色。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2022-6-30 09:05:13 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-6-29 19:47
isotype不太容易匹配。
如果确保是匹配的,那么FAP应该是胞内标记吧,试一下破膜后,洗涤后Fc阻断,然后再 ...

isotype是同一maker推荐的,在和其他FAP阳性细胞一起进行流式分析时候匹配的挺好的,所以isotype本身应该问题不大。
FAP细胞表面和游离的都存在,我们这次是想分析表面的FAP表达情况,用的活细胞染色,所以不能固定破膜。
因为还做了其他的验证,PCR,WB,所以待测细胞应该是极少表达FAP没有问题。
但是isotype对照组荧光值高这么多常见吗?还是说确保操作没有问题的话,这个结果也是正常的?
感谢倪老师解答。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2022-6-30 21:09:26 | 显示全部楼层
steven 发表于 2022-6-30 09:05
isotype是同一maker推荐的,在和其他FAP阳性细胞一起进行流式分析时候匹配的挺好的,所以isotype本身应该 ...

从这里描述的意思看,是以前用isotype设门都没问题,就最近这几个出问题?
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2022-7-4 12:03:55 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-6-30 21:09
从这里描述的意思看,是以前用isotype设门都没问题,就最近这几个出问题? ...

之前都是FAP阳性细胞,所以用isotype设门的话,FAP+细胞荧光值都是高于isotype的,没看出来有什么问题。这次是FAP-细胞,竟然荧光值比isotype还低
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2022-7-4 13:20:28 | 显示全部楼层
steven 发表于 2022-7-4 12:03
之前都是FAP阳性细胞,所以用isotype设门的话,FAP+细胞荧光值都是高于isotype的,没看出来有什么问题。 ...

这样的话,我倒觉得反而能证实了isotype设门不适合,更加说明了既往FAP+细胞比例偏低了。

改为Fc阻断设门吧。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2022-7-5 10:59:11 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-7-4 13:20
这样的话,我倒觉得反而能证实了isotype设门不适合,更加说明了既往FAP+细胞比例偏低了。

改为Fc阻断设 ...

确实是啊,还没考虑到这个问题。
FC阻断的话,是control用FC blocker,然后待测样本用FC blocker+FAP 1stAb这个方案吗?

https://www.bio-rad-antibodies.c ... yCookieEnabled=true
刚才又读了一下Bio-rad厂商对isotype的说明,isotype可以确认观测到的荧光来自于抗体的特异性结合,但是不能用来界定阴性和阳性细胞,或者划门。这话该怎么理解啊?都确认了是特异性荧光了还不能划门?是因为有假阴性吗,就像我这次的这种,isotype实际造成了背景升高?

感谢倪老师解答,一直就对isotype这里的知识模模糊糊,正好有这个机会,想弄的明白点。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2022-11-8 17:11:47 | 显示全部楼层
steven 发表于 2022-7-5 10:59
确实是啊,还没考虑到这个问题。
FC阻断的话,是control用FC blocker,然后待测样本用FC blocker+FAP 1st ...

楼主现在有答案吗? 到底怎么判断是不是isotype抗体的问题呢
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2022-11-9 07:35:37 | 显示全部楼层
Jeffery_9 发表于 2022-11-8 17:11
楼主现在有答案吗? 到底怎么判断是不是isotype抗体的问题呢

以前讲过类似的事情:

同型对照荧光比抗体强,咋办?阻断!
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html
(出处: 流式中文网)
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2022-11-9 09:03:54 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-11-9 07:35
以前讲过类似的事情:

同型对照荧光比抗体强,咋办?阻断!

倪老师,那BD的Human Fc block可以封闭mouse的细胞吗? anti-mouse CD16/CD32 是不是排除不了CD64的影响?
谢谢!
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2022-11-28 18:33

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.