流式染DCFH-DA测ROS

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各位老师好，最近用流式（贝克曼）测心肌细胞（贴壁）的ROS，试剂盒是碧云天的DCFH-DA步骤：1. 先消化细胞，然后加含血清的培养基终止消化
          2. 收集细胞，离心（1000rpm X 5min）洗涤去除胰酶和血清
          3. 无血清培养基重悬细胞，根据说明书加染料（1ul/ml培养基），放细胞培养箱中孵育20min，每5min摇一下
          4. 离心4次，洗涤去除染料
          5. 预冷的PBS重悬，上机检测，每组收集20000个细胞

这是我的实验结果，学生有以下几个问题请求老师解惑：
1. 请问我的FSC,SSC圈门是否科学可行
2. 各组FSC,SSC圈出来的P1细胞群比例差很多，导致p1门内的细胞数差很多，最后layout图片中纵坐标的count数不一样，高低不一，我看高分文献大家的count峰都差不多高，不会差太多，我这样的结果可以嘛？
3. 理论上，最后统计的平均荧光强度MFI，是不是已经除以了细胞个数，所以不用在意count，只用统计geometric mean就行了
4. 我的数据，横坐标对数值都很大，Gometric Mean值都超级大，文献中别人的Blank组都只有2次方左右，我的随便出来就是4次方，6次方，可能与细胞种类有关，所以最近养了其他细胞，排除一下这方面的影响

niwanmao

1、如果你要分析的靶细胞在此区域，这样圈没问题。
2、比例没关系，不同的处理，肯定会使得最后细胞数有相差，最后的直方图，可在flowjo中用mode形式均一化：
怎么使用Flowjo的Normalized to mode功能
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8340-1-1.html
(出处: 流式中文网)


3、MFI与细胞数无关，但细胞数越多，MFI越可靠。
4、数值不要紧，与仪器有关，最后的统计本身就是与对照相比。

1092749312@qq.c

niwanmao 发表于 2022-7-13 11:00
1、如果你要分析的靶细胞在此区域，这样圈没问题。
2、比例没关系，不同的处理，肯定会使得最后细胞数有相 ...

谢谢老师