新手请教CD8+T细胞圈门问题

面团胖宝宝

第一次做流式，我是从外周血中通过免疫磁珠阳性分选出CD8+T细胞，CD3/CD28激活，通过对CD8+T细胞加药物干预48h后测CD8+T细胞的表面抗原变化。请问各位大神，我的标本已经是CD8+T单细胞悬液了还用加CD3抗体在CD3里边圈门吗？另：这是我第一次做流式时圈的门，第一张图是空白组，第二张图是是APC-CD8,PE-CXCR3，请各位大神帮我看一下我的圈门正确吗？P2那个门每个管细胞数目差异很大，不知为何？

niwanmao

1、FSC的阈值要加大，排除掉左边这些大量的碎片。那样的话，P2门比例总体不会相差太大。
2、如果之前确认过纯度很高，那么CD3不加也行，但如果分选后纯度不够，那么还是建议加。
3、CXCR3的分群不好。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-7-17 09:58
1、FSC的阈值要加大，排除掉左边这些大量的碎片。那样的话，P2门比例总体不会相差太大。
2、如果之前确认过 ...

谢谢倪老师回答！问题有些多不好意思~
1.我每管阈值都是设的7000，可是各管P2比例相差大，这是样本的问题吗？细胞碎片多也是因为制样本时间太长吗？
2.以前做过一次流式，纯度在98%以上，但是只做过一次
3.CXCR3分群不好是怎么看的呢？不太理解，如何解决呢？

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-7-17 10:03
谢谢倪老师回答！问题有些多不好意思~
1.我每管阈值都是设的7000，可是各管P2比例相差大，这是样本的问题 ...

1、阈值不是指获取的细胞数，而是FSC的阈值，意思是低于此FSC数值的信号不保存、不获取。
2、纯度可以。
3、CXCR3一般阳性群和阴性群是能够明显分开的。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-7-17 11:48
1、阈值不是指获取的细胞数，而是FSC的阈值，意思是低于此FSC数值的信号不保存、不获取。
2、纯度可以。
...

对，我就是阈值设的7000，不是细胞数

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-7-17 23:15
对，我就是阈值设的7000，不是细胞数

从图上看，FSC的阈值，理论上是应设置在0.2×10E6，即20万左右。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-7-18 07:01
从图上看，FSC的阈值，理论上是应设置在0.2×10E6，即20万左右。

十分感谢倪老师！

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-7-18 07:01
从图上看，FSC的阈值，理论上是应设置在0.2×10E6，即20万左右。

倪老师，最后还想请教一下，我这个门圈的对吗？

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-7-18 12:30
倪老师，最后还想请教一下，我这个门圈的对吗？

门可以，最好是对CXCR3优化一下。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-7-18 15:23
门可以，最好是对CXCR3优化一下。

倪老师您好，听您的解答更改阈值后有了很大的改善，CCR5能有分群，可是CXCR3还是无法分群只有比例上的变化，请问是哪里出了问题呢？我应该如何优化？