线粒体膜电位检测jc-1阳性对照和阴性对照没啥区别

龙少1942

我的实验是做的海洋动物鳃细胞，用的碧云天增强型试剂盒，345是阴性对照（取下组织室温消化20min,然后加jc-1避光孵育20min上机流式），789是阳性对照（取下组织室温消化20min,加入cccp细胞中浓度10um，然后加jc-1避光孵育20min上机流式），我的问题是阳性对照并不是很明显，不知道是什么原因，到底是操作问题还是流式采集参数设置问题。

niwanmao

JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗？
看起来只有阳性9的群体比较明显，右侧有一个相对较明显的凋亡群体（虽未完全分开，但可看的到）。

是否存在样本操作的不稳定？

wxd

线粒体膜电位的结果分析，很难用横平竖直的十字门来进行分析，比较普遍的是将UR和LR之间的那条线画成斜向上的。你可以尝试一下这个画门方法。
不行的话，可能需要做JC-1的染色时间的染色条件优化。我之前用小鼠细胞系做的效果比较好的，JC-1的染色时间是一个小时左右。你做的是海洋动物腮细胞，染料自由扩散进入细胞内部的速度等可能和陆地上的动物不太一样。

龙少1942

niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗？
看起来只有阳性9的群体比较明显，右侧有一个相对较明显的凋亡群体（ ...

您好老师，基本上是按照说明书来的，就是孵育温度没有按照说明书那个来，因为我的这个物种承受不了37度所以就按室温孵化的，我又换了种方法，之前是胰酶消化这回直接是机械捶打下来的。目前的问题主要有以下问题：1、很多信号在x轴下面调节对应通道的电压（b585）也无法解决2、染剂会有一些红色絮状颗粒不知道会不会对结果有影响（温浴，超声促融都试了）3、目前流式采集参数还有哪些需要改进的，我害怕是流式没调明白

龙少1942

niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗？
看起来只有阳性9的群体比较明显，右侧有一个相对较明显的凋亡群体（ ...

今天换了种方法，这是今天跑的阴性对照，会看到，有一些细胞在x轴下面，调对应电压（b585）电压也不好使，在一个阴性对照竟然有很多下降的，不知道是我操作的问题还是流式调节的问题

龙少1942

wxd 发表于 2023-9-12 10:03
线粒体膜电位的结果分析，很难用横平竖直的十字门来进行分析，比较普遍的是将UR和LR之间的那条线画成斜向上 ...

您好，我这个门就是先大概看一下趋势，我们海洋动物首先没有完善的细胞系，只能用原代培养的和传一俩代的做，还得调节渗透压，参考的是类似的物种类似的细胞

niwanmao

龙少1942 发表于 2023-9-12 11:02
您好老师，基本上是按照说明书来的，就是孵育温度没有按照说明书那个来，因为我的这个物种承受不了37度所 ...

胰酶消化的时间、机械吹打的力度，可能是都是影响因素。

至于絮状颗粒，是由于JC-1加入的时候，你应该未进行边振荡边滴加的形式吧？既需要充分振荡，又不能太剧烈。参见：
流式细胞术检测凋亡方法1－罗丹明123、DiOC6(3)、JC-1染色
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-191-1-1.html
(出处: 流式中文网)

xuts

niwanmao 发表于 2023-9-12 08:40
JC-1染色步骤是按照该试剂盒说明书吗？
看起来只有阳性9的群体比较明显，右侧有一个相对较明显的凋亡群体（ ...

老师，想请教个问题，分析线粒体膜电位JC-1的时候FSC-A和SSC-A是否需要将坏死或凋亡的细胞圈上，就像分析凋亡PI和annexin，第一个前向侧向图除了碎片处的位置都圈上一样？

niwanmao

xuts 发表于 2023-9-13 16:07
老师，想请教个问题，分析线粒体膜电位JC-1的时候FSC-A和SSC-A是否需要将坏死或凋亡的细胞圈上，就像分析 ...

膜电位是早期事件，我个人建议不圈坏死或凋亡的细胞。坏死或凋亡的细胞可另外计算。这样的话，你呈现结果的时候，可给出：
正常细胞a％，线粒体膜电位降低的早早期凋亡细胞b％，Annexin V+的早期凋亡细胞c％，坏死或晚期凋亡的细胞d％。

龙少1942

niwanmao 发表于 2023-9-12 12:32
胰酶消化的时间、机械吹打的力度，可能是都是影响因素。

至于絮状颗粒，是由于JC-1加入的时候，你应该未 ...

您好老师，请问阳性对照是这样是否合理，我延长了处理时间和浓度