细胞周期流式求助！

刘文

zjl894150094 发表于 2023-10-12 11:57
我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fo ...

还没有解决，我现在是cv值过高。刚开始是一个单峰（细胞密度过高），现在是做别的实验了，这个做了2月都没做出来，准备先做别的，等我解决了再说😭

macxuao

如果细胞状态没有太大问题，一般这个操作步骤应该没问题的，建议仪器做个QC 看一下微球的CV如何，如果仪器QC的CV都很大，实验步骤如何优化都没用的。

niwanmao

刘文 发表于 2023-10-12 20:56
好的，谢谢。我是用的无水乙醇。
250ulPBS+750ul无水乙醇

应是 700ul无水乙醇+300ul纯水，并且没必要一管一管单配，而是可以批量一起配大体积，可以多一点70％冰乙醇固定。

wxd

无水乙醇溶于水放热，所以你向250微升PBS中加预冷的无水乙醇，意义可能不大。还是建议先配好乙醇，预冷后直接加。
说明书上要求固定后进行清洗，以去除残留的乙醇。但其实你可以试试不清洗，仔细弃干净乙醇后，直接加染色液。这个方法经我们验证，是可以得到可接受结果的。
检测时，不要只用PE通道，根据经验，PerCP通道的检测结果可能会比PE通道更好一些。
另外，看你放上来的这个图，你好像没有去除细胞碎片和粘连细胞，可以看看是不是这个的原因。
如果实在做不出来，可以尝试换一个常用的细胞（比如Hela）用同样的方法染色检测一下，看看结果是不是正常的，如果换一个细胞结果就正常了，说明你的这个细胞，细胞周期的结果就是这样的。
有条件的话，尝试用活细胞做细胞周期，比如用DAPI/H33342(405nm激光器激发的蓝色荧光)、SYTO 9/SYBR Green I（488nm激光器激发的绿色荧光）、SYTO 63（633 nm激光器激发的红色荧光）进行染色。具体做法就是在培养细胞的时候，将染料加入培养基中，培养2h以上。需要注意SYBR Green I我们确定可以染色活细菌，但活的动植物细胞没染过，需要确认一下。

刘文

wxd 发表于 2023-10-13 10:06
无水乙醇溶于水放热，所以你向250微升PBS中加预冷的无水乙醇，意义可能不大。还是建议先配好乙醇，预冷后直 ...

好的，谢谢

刘文

niwanmao 发表于 2023-10-13 08:11
应是 700ul无水乙醇+300ul纯水，并且没必要一管一管单配，而是可以批量一起配大体积，可以多一点70％冰乙 ...

好的，谢谢

刘文

macxuao 发表于 2023-10-13 00:14
如果细胞状态没有太大问题，一般这个操作步骤应该没问题的，建议仪器做个QC 看一下微球的CV如何，如果仪器Q ...

好，谢谢

zjl894150094

刘文 发表于 2023-10-12 20:58
还没有解决，我现在是cv值过高。刚开始是一个单峰（细胞密度过高），现在是做别的实验了，这个做了2月都 ...

我今天又复测了一下，发现是我的fortessa流式仪电压没调好，电压太高了，细胞飞了。按照老师们的protocol，顺利得到了周期图。