JC-1检测如何让膜高电位红光比值变大？

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各位老师好，不好意思又来打扰了。。。我是最近才学习JC-1检测的，有2个问题想请教一下您们。
下面2张图是我刚测试的一个样本，同步测了阳性对照。

测试操作：37℃染色15min，JC-1工作液浓度5ug/mL，1500rpm离心洗涤1次，300uL重悬上机。

样本是新鲜的，试剂是碧云天的，还有几天过期。为什么测出来跟网友们的高电位相差那么大，我测过好几次了，正常高电位样本都是只能测到红光30%~50%左右。

问题如下：

1.如何提高红光的比值？比如染色流程方面，有什么细节会不小心导致膜电位降低。

2.JC-1是亲脂阳离子羰花青染料，-20℃保存一年，最大冻融次数一般不超过5次，那放在4℃不就可以避免反复冻融了吗？老师知道-4℃大概能保存多久吗？

wxd

如果这个试剂盒剩的不多了，你可以考虑买一盒新的。买回来之后，根据每次实验的用量，分装保存（比如每次实验用大概5-8份，那就按10份的量分装一支），用一次拿一支。可以避免反复冻融。

从经验上来说，用培养基代替染色缓冲液来稀释JC-1，并且在细胞培养箱中进行孵育效果会好一些。另外，细胞和细胞也是不一样的，说明书上是一个通用的方法，适用于大多数普通的细胞，但是具体到你自己的实验，可能需要你来优化这个染色条件（主要是染色时间）。
另外你还需要考虑：有可能你的细胞本来就是这样的，就是有一部分细胞的膜电位是降低的， 但是细胞又是活的。这个你有研究条件的话就搞清楚是不是这样，没有条件的话，用罗丹明123来染色检测膜电位，这个染料只用FITC通道，高电位荧光强，低电位荧光弱，只需要比较FITC通道的平均荧光强度就行了。

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wxd 发表于 2023-11-3 13:46
如果这个试剂盒剩的不多了，你可以考虑买一盒新的。买回来之后，根据每次实验的用量，分装保存（比如每次 ...

好的谢谢老师，JC-1重悬样本的时候，是不是用手轻轻摇一下就好了，不能剧烈？我总感觉我摇得剧烈了些。。。

wxd

这个是不用担心的，细胞没有你想的那么脆弱。与其担心这个，你更应该想一下是不是消化细胞或者研磨组织导致的细胞状态不好。

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wxd 发表于 2023-11-3 16:31
这个是不用担心的，细胞没有你想的那么脆弱。与其担心这个，你更应该想一下是不是消化细胞或者研磨组织导致 ...

好的，谢谢