脾细胞的分离、冻存和复苏

niwanmao

脾细胞是ELISpot和FluoroSpot测定中使用最多的细胞，至少对小鼠和大鼠样本而言是如此。脾细胞可以很容易地从脾脏中分离出来，而不需要Ficoll分离。细胞可以在分离后直接使用，也可以冷冻保存，并在以后批量使用。

下面是编译自https://www.mabtech.com/knowledg ... thawing-splenocytes的关于如何最好地（i）分离、（ii）冻存和（iii）复苏脾细胞的详细指南。

脾细胞的分离
### 材料
- 细胞过滤器，70µm尼龙，无菌
- 无菌剪刀和镊子或镊子
- 无菌培养皿
- 巴氏移液管，无菌
- 无菌注射器，3毫升或5毫升（无针）
- 聚丙烯离心管：15 ml，无菌
- 培养基：RPMI 1640，已添加100µg/mL青霉素+100µg/mL链霉素

### 步骤
1. 把脾脏倒进培养皿里。如有需要，使用剪刀、镊子或镊子去除多余的脂肪和组织。
2. 将细胞滤网放入新的培养皿中，将脾脏转移到滤网中。加入5毫升培养基。
3. 使用注射器的扁平柱塞端，通过细胞过滤器将脾脏匀浆到培养皿中。
4. 用5 ml培养基将细胞滤网中的细胞冲洗到培养皿中。
5. 将脾细胞从培养皿转移到15ml离心管中。
6. 将试管静置一分钟，让大块沉淀物沉淀或使用无菌巴斯德移液管去除团块和粘连体。将脾细胞悬浮液转移到新的15ml离心管中，再加入培养基重悬。
7. 以300 x g离心10分钟。
8. 去除上清并将细胞沉淀重悬于15ml培养基中。
9. 记下体积，取一小份进行细胞计数。
10. 以300 x g离心10分钟。（提示：在此步骤中对细胞进行计数）
11. 如果要立即使用细胞，则去除上清后，并通过轻轻吹打将细胞沉淀重悬于细胞培养基中，就可以用于基于细胞的免疫测定，如ELISpot、FluoroSpot和流式细胞术。如果需要冻存细胞，则进入下一步。

脾细胞的冻存
### 材料
- 冷冻培养基：RPMI 1640（含 2 mM L-谷氨酰胺），+ 20%FCS和10%DMSO。如果细胞使用的是无血清培养基，请使用 7%DMSO
- 冷冻容器，例如“CoolCell”或“Mr.结霜”
- 聚丙烯离心管：50 mL和/或15 mL，无菌
- 自动移液器和无菌吸头
- 冻存管，例如1.8 mL
- -80℃冰柜
- -150℃冰柜或液氮罐

### 步骤
1. 接着上一节第11步，去上清，在冷冻培养基中将细胞稀释至浓度为5-2500万个细胞/ml。如果您使用的是无血清冷冻培养基，则使细胞浓度达到100万个细胞/ml。
2. 分装，例如，每支冻存管中分1 mL，并将冻存管转移至冷冻容器中。确保通过不断重悬使细胞保持悬浮状态。
3. 迅速将冷冻容器置于-80℃冰箱中，并储存至少4小时，最多1周。
4. 将冻存管从冷冻容器中转移至-150℃冰箱或液氮罐中长期储存。

脾细胞的复苏
### 材料
- 细胞培养基：RPMI 1640（含 2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%FCS、10 mM HEPES和100 µg/mL青霉素 + 100 µg/mL链霉素
- 37℃水浴
- 聚丙烯离心管：50 mL和/或15 mL，无菌
- 移液器和移液器男孩
- 自动移液器和无菌吸头
- 室温离心机
- CO2 培养箱 (37°C)

### 步骤
1. 将冻存管从冷冻库中迅速转移至37℃水浴中，解冻细胞，直至仅剩余少量冰晶。
2. 向冻存管中缓慢加入0.5-1 mL细胞培养基，重悬细胞，并从冻存管中转移至 15 mL 试管中。用 1 mL 细胞培养基冲洗冻存管，并将剩余细胞继续转移至 15 mL 试管中。最后再向试管中加入更多的细胞培养基。
3. 以 300 xg 离心10 min。
4. 去上清，轻拍试管，使沉淀物不那么致密。通过缓慢上下吸液，将细胞重悬于 1 mL 细胞培养基中。加入细胞培养基至总体积为15 mL。
5. 以 300 xg 离心10 min。
6. 去上清，将沉淀重悬于 1 mL 细胞培养基中。添加更多的细胞培养基（例如，5 mL，取决于预期的细胞数量和所需的细胞浓度）。
7. 将细胞置于 CO2 培养箱中1小时。保持瓶盖略微打开。（冻存培养基含有对细胞有毒性的DMSO，如果你要复苏多管，建议少拿几管操作，需尽快从第1步进到第2步）。
8. 孵育后，重悬细胞，并使聚集的细胞碎片或团块沉淀（大约需要1 min）。然后小心地将没有碎片的细胞悬液转移到新的 15 mL 试管中。
9. 计数细胞并测定细胞活力。可使用自动细胞计数器或使用显微镜的台盼蓝染色进行计数。如果细胞浓度低于所需浓度，再次离心细胞，重悬并稀释至正确体积。

家的感觉

感谢倪老师分享！有个疑问，脾淋巴细胞冻存、复苏后用特异抗原刺激后，能否用ELISA定量检测上清细胞因子、流式检测胞内因子与ELISPOT检测细胞因子？实验室学生之前做过刺激后检测效果不行，但新鲜细胞是可以的，大家有没有做过这方面的，谢谢分享！

niwanmao

家的感觉 发表于 2024-3-13 08:14
感谢倪老师分享！有个疑问，脾淋巴细胞冻存、复苏后用特异抗原刺激后，能否用ELISA定量检测上清细胞因子、 ...

功能实验，通常新鲜最有保障。

至于复苏后的细胞做功能学试验，文献看到也不少，我觉得效果不好的原因可能更多是出在冻存、复苏的细节上，导致最后复苏后的活力差，从而使功能出问题

家的感觉

niwanmao 发表于 2024-3-13 09:37
功能实验，通常新鲜最有保障。

至于复苏后的细胞做功能学试验，文献看到也不少，我觉得效果不好的原因可 ...

是的，最好还是用新鲜细胞做保险一些

刘传隆

脾脏分离不需要裂红吗？捣碎了离心后沉淀会有很多红细胞

DC_Cooper

刘传隆 发表于 2024-3-20 10:53
脾脏分离不需要裂红吗？捣碎了离心后沉淀会有很多红细胞

需要裂红