pi染色和modfit分析问题

中苦

    最近做了一次流式，细胞数量和染色均不太满意，modfit也不怎么会用，所以请大家提出宝贵的意见。流式细胞仪用的是美国的BD   C6，由于它的工作电压是设定好的，所以不能调节，试剂用的是染色缓冲液、碘化丙啶染色液20X（pi），RNaseA50X，操作大概如下：收集细胞，1000rm离心，1mlpbs重悬，再离心，1ml70%乙醇固定过夜，再离心，1mlpbs重悬，离心，将配好的三种液体混匀，以每管0.5ml加入细胞中，在二通道检测红色荧光和光的散射，光的散射检测做流式的不会，不知有没有检测，得出结果如下：
想问一下问题出在哪，怎么改进，还想问一下modifit 4.0怎么用，参数fl2 只有fl2-a和fl2-h  ，怎么设置   
附件里有我的fcs文件，欢迎查看

niwanmao

C6的数据导出来还真的是没几个软件可以分析，幸亏借助ACEA Novocyte配套的Novoexpress解决了，不过由于NovoExpress目前还无法分析凋亡，所以暂时没法提供凋亡数据。

从整个数据看，只有A01的细胞状态好，可以分析出完整的G2、G1、S期比例，但其它几例数据都不行，没几个正常的细胞，都是碎片。

A01拟合结果见下：

A01拟合结果

A02开始就不行了，真正的细胞少之又少。

A02

即使不断缩放，将碎片圈进去，并尝试周期分析，发现不仅峰的形态不对，而且无法拟合

中苦

多谢啊   A01是对照组   其他几组都是种六孔板加药处理后的数据， 想问版主实验能不能继续做下去 要是能做的话 该怎么实行  请指教

niwanmao

中苦 发表于 2013-12-19 22:25
多谢啊   A01是对照组   其他几组都是种六孔板加药处理后的数据， 想问版主实验能不能继续做下去 要是能做 ...

如果细胞死的这么多，我觉得你在药物浓度或作用时间上需要降低

中苦

我不担心药物浓度问题，细胞死的多，我加大种板数量与面积就行了，  我是想问做出来的数据可不可以分析,能不能计算出周期和凋亡率，不然后面的实验没办法做

niwanmao

中苦 发表于 2013-12-20 22:32
我不担心药物浓度问题，细胞死的多，我加大种板数量与面积就行了，  我是想问做出来的数据可不可以分析,能 ...

细胞死的多周期就没法分析了啊，这种纯粹都是坏死性质的，而非凋亡，因此你的周期压根就不能分析。所以药物不能太浓就是这个意思。

中苦

     那有什么办法，可不可以把死细胞去除，或者加大细胞收集的数量

niwanmao

中苦 发表于 2013-12-21 20:18
那有什么办法，可不可以把死细胞去除，或者加大细胞收集的数量

把死细胞去除就是上面这种方法，是可以加大细胞收集的数量，例如仅让流式细胞仪收集门内的细胞。但是你觉得这个药物导致这么多细胞死亡，有意义吗？比如将这个药物用在病人身上，把病人的细胞都杀死了，虽然肿瘤细胞没了，但病人的正常细胞也都没了，毒性太大了。

中苦

有没有意义不是我们说了算，现在没意义，以后可能有意义，我想用60mm的培养皿来收集细胞，你觉得数量够吗，不够的话是不是要用25cm的培养瓶或是100mm的培养皿

sally_no10

中苦 发表于 2013-12-21 23:05
有没有意义不是我们说了算，现在没意义，以后可能有意义，我想用60mm的培养皿来收集细胞，你觉得数量够吗， ...

我同意倪老师说的.这么大比例的死亡,意义是会受到质疑的.在成文投稿的时候,可能会遇到这样的问题.药物作用的浓度和时间,是需要调整到合适的位置,才可以做出合适的效应.有些药物在不同的浓度,对细胞的杀伤和刺激是截然不同的.飙出其他的剂量毒性反应,任何药物的合适效应都会受到影响.
如果你的杀伤效果太强,死细胞太多,你收再多的细胞,做出来的周期也不会得到很好的拟合,反而可能由于药物和流式收集数据上的"筛选"作用,反应不出真实的比例和情况.
我个人的感觉,做周期是应该做出arrest,而不是做到最大效应.即使要做凋亡,把握刺激的度也很关键.因为目前常见的凋亡检测方式,都是做早中凋的.如果刺激过度,贴壁或者半贴壁细胞冲进晚凋,飘得厉害,你去掉了反而也就把效应去掉了.即使收集起来或者是悬浮细胞,也区分不了坏死和凋亡.
有没有意义确实不是我们说了算,但是数据反映真实情况的效价,确实是由我们把握的.祝实验顺利.