做小鼠全血淋巴细胞亚群分析时，为什么细胞状态不好？

枫叶131124 · 发表于 2014-6-23 20:30:10

本帖最后由枫叶131124 于 2014-6-23 20:36 编辑

本人最近做小鼠全血T细胞亚群检测，得到的细胞数目要么很少要么纯度不行，不知道什么原因，麻烦各位帮忙分析一下。我的实验过程如下：1、采集小鼠外周全血：暴露眼球，用蘸有肝素钠的棉签擦拭眼周，弯镊子摘除眼球取血，将血滴于肝素钠抗凝管中，颠倒 3-5 次。
2、取200μL抗凝全血加入600μL红细胞裂解液，室温摇晃孵育1min后，迅速加入1.2mlPBS终止反应。4℃,1000r,5min离心，弃上清。用PBS重悬细胞，细胞计数。

3、将细胞调整到1x107个/mL后，用200目尼龙网过滤。

4、用1.5mL离心管取100uL细胞加入抗体混匀。

双色荧光染色法：APC-anti-Rat-CD3e、FITC-anti-mouse-CD4、PE-anti-mouse-CD8a

5、加完抗体后室温孵育15min。4℃,1000r,5min离心弃上清，用500μL PBS洗2次。

6、用400μL固定液固定细胞后上机。

  关于红细胞裂：对于加入红细胞裂解液的比例，我看文献中大部分用细胞：裂解液=1:3，按照此方法我得到的细胞数目特别少；我尝试过用不同的比例，发现裂解液太少会导致裂解不完全，影响后续的实验，裂解液多的时候，细胞数目又特别少。关于裂解时间，文献上有介绍裂解10min或者5min，我裂解3min，离心后基本看不见白细胞，裂解1min才勉强可以，裂解时间少于1min后又裂解不完全。所以不知道哪个环节出问题了，请各位赐教。

  关于抗体标记：我发现标记上的抗体数量特别少，单抗管标记上的都不到20%，不知道是什么原因？
  补充一下：红细胞裂解液是参照倪老师的氯化裂解液配的，裂解脾脏红细胞时效果很好。
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-206-1-1.html(出处: 流式中文网)

niwanmao · 发表于 2014-6-23 20:37:57

本来你把散点图或原始文件传上来会看得更明白。
不过似乎你一共只取了200ul血，这样的话细胞量本来就少，再加上裂解、离心时丢失一些细胞，剩下更少。

裂解的话，我们在人外周血和骨髓标本中的经验是：裂解液1：20，裂解10分钟。

fernazy · 发表于 2014-6-23 21:59:52

2、取200μL抗凝全血加入600μL红细胞裂解液，室温摇晃孵育1min后，迅速加入1.2mlPBS终止反应。4℃,1000r,5min离心，弃上清。用PBS重悬细胞，细胞计数。
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我做的时候是取100ul小鼠血加红细胞裂解液2ml，5-10分钟后离心弃上清，加PBS重悬后进行抗体孵育

枫叶131124 · 发表于 2014-6-23 22:15:40

fernazy 发表于 2014-6-23 21:59
2、取200μL抗凝全血加入600μL红细胞裂解液，室温摇晃孵育1min后，迅速加入1.2mlPBS终止反应。4℃,1000r, ...

100ul血可以得到多少细胞呢？

fernazy · 发表于 2014-6-24 20:33:43

枫叶131124 发表于 2014-6-23 22:15
100ul血可以得到多少细胞呢？

表面染色的话可以取到2*105个左右

枫叶131124 · 发表于 2014-6-25 21:55:46

fernazy 发表于 2014-6-24 20:33
表面染色的话可以取到2*105个左右

好的，我参照你的方法试验一下。谢谢~

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