大鼠th1/th2细胞因子检测

baolei0606

最近做大鼠th1/th2。实验步骤如下，预实验的结果在附件中，想让大家看看结果如何，如何可以的话就做正式实验了，谢谢大家。1.用肝素抗凝取2ml大鼠全血，进行淋巴细胞提取，调整细胞浓度为10的6次方，加入2μlbd公司的Leukocyte Activation Cocktail

2.置于细胞培养箱4-6小时

3.500g离心5min，弃上清

4.每管加入2ml staining buffer，500g离心5min，弃上清

5.每管加入100μl staining buffer重悬细胞，并加入表面抗原抗体（CD3、CD8）1μl、2.5μl(0.5μg/106cells)，室温避光孵育15min。加入2ml stainingbuffer，500g离心5min，弃上清

6.加入bd公司的500μl Fixation/Permeabilization solution，涡旋，室温避光20min。500g离心5min，弃上清

7.每管加入2 ml BD Perm/Wash buffer，室温避光孵育10min，500g离心5min，弃上清

8.每管加入100μl Perm/Wash buffer重悬细胞，并加入胞内抗原抗体il-4和IFN-γ2.5μl（0.5μg/106cells），室温避光30min

9.每管加入2 ml BD Perm/Wash buffer，500g离心5min，弃上清

10.500μlPBS/2%paraformaldehyde solution悬浮细胞，上流式。

niwanmao

IFN的比例比较低，不过IL-4和IFN似乎都还是有点稀稀拉拉的阳性，不知道这个比例和你们预想的是不是偏差比较大？
见下图（PS：你们使用的是不是C6仪器？荧光范围很大）

baolei0606

niwanmao 发表于 2014-6-24 19:27
IFN的比例比较低，不过IL-4和IFN似乎都还是有点稀稀拉拉的阳性，不知道这个比例和你们预想的是不是偏差比较 ...

是啊，倪老师，IFN比较低是不是有可能是刺激剂的问题？

niwanmao

baolei0606 发表于 2014-6-24 21:31
是啊，倪老师，IFN比较低是不是有可能是刺激剂的问题？

有可能没有活化好。

baolei0606

niwanmao 发表于 2014-6-24 21:34
有可能没有活化好。

我刺激剂用的是bd公司的leukocyte activation cocktail，with bd golgiplug。

niwanmao

baolei0606 发表于 2014-6-24 21:42
我刺激剂用的是bd公司的leukocyte activation cocktail，with bd golgiplug。

用CD69做一下活化的质控试试：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1450-1-1.html

baolei0606

niwanmao 发表于 2014-6-24 22:02
用CD69做一下活化的质控试试：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1450-1-1.html

倪老师，为什么我加刺激剂培养5小时后，离心 ，细胞沉淀几乎没有呢？

niwanmao

baolei0606 发表于 2014-6-25 21:04
倪老师，为什么我加刺激剂培养5小时后，离心 ，细胞沉淀几乎没有呢？

离心速度？镜下观察是否有细胞？

baolei0606

niwanmao 发表于 2014-6-25 21:12
离心速度？镜下观察是否有细胞？

500g 10min ，之前调整细胞浓度10的6次方。

niwanmao

baolei0606 发表于 2014-6-25 21:13
500g 10min ，之前调整细胞浓度10的6次方。

多少转/分？离心后有没有在镜下观察过细胞，是不是碎了