7AAD单染-细胞周期

fdgg012345

想用7AAD单染（替代PI）做细胞周期分析，在论坛查到倪老师发的步骤，是用预冷的70%乙醇固定后染色。没有用打孔剂。我想知道，不打孔7AAD就能很好进入细胞核吗？如果用1%多聚甲醛来固定可以吗？@niwanmao

chilliping

没用过7AAD，不过我觉得应该跟PI原理是一样的。乙醇应该也有一定的打孔作用。
为什么要用7AAD，不用PI呢？

niwanmao

不打孔只能检测细胞死活，只有破了核膜后，才能检测细胞周期。跟PI一个道理。

fdgg012345

chilliping 发表于 2014-9-17 16:24
没用过7AAD，不过我觉得应该跟PI原理是一样的。乙醇应该也有一定的打孔作用。
为什么要用7AAD，不用PI呢？ ...

因为我同时还要染其他两个膜指标，是pe，fitc标记的，如果用pi会同时占据两个通道，就不能一起染了。

fdgg012345

niwanmao 发表于 2014-9-17 21:30
不打孔只能检测细胞死活，只有破了核膜后，才能检测细胞周期。跟PI一个道理。 ...

倪老师，我做了一下预实验。固定和破膜用的是bioscience的foxp3+试剂盒里的试剂：perm/fix、perm buffer
A.perm/fix固定30min, perm buffer洗涤一次，加入含10ug/ml 7AAD的perm buffer 100ul，室温避光孵育30min
C.perm/fix 洗涤了一次，加入含2.5ug/ml 7AAD的FACS buffer 100ul ,室温避光孵育30min


结果如下图，第一个是A, 第二个是C。本来C是整备既不固定也不破膜的，后来不小心加perm/fix洗了一次，7AAD只加了染死-活细胞的量，结果也可以染出类似的图形。两组细胞是一样的，是结肠癌细胞SW480，复苏后过了一晚就做了。CV值不达标，其他还可以。但是图形跟第三个这种图相差有点远啊，不知道是染得不过关，还是细胞本来就这样，倪老师可以帮忙分析一下吗？非常感谢！

A

C

niwanmao

fdgg012345 发表于 2014-9-22 12:51
倪老师，我做了一下预实验。固定和破膜用的是bioscience的foxp3+试剂盒里的试剂：perm/fix、perm buffer
A ...

FSC/SSC散点图和FL3-A/FL3-H散点图分别是怎么样的？

fdgg012345

niwanmao 发表于 2014-9-22 19:44
FSC/SSC散点图和FL3-A/FL3-H散点图分别是怎么样的？

由于做流式的老师不知道怎么同时收集A,H,W，是老的 BD calibur，我查了一下，是不是调成DDM模式，可以收集？所以这次没有收集这两个参数，无法排除粘连体。另外，我这个细胞株，本身就存在较多的融合细胞，非整倍体细胞应该也比较多。

niwanmao

fdgg012345 发表于 2014-9-22 21:42
由于做流式的老师不知道怎么同时收集A,H,W，是老的 BD calibur，我查了一下，是不是调成DDM模式，可以收 ...

因为你用的是7-AAD，所以要调成FL3的DDM。

燕仔zoe

fdgg012345 发表于 2014-9-18 11:06
因为我同时还要染其他两个膜指标，是pe，fitc标记的，如果用pi会同时占据两个通道，就不能一起染了。 ...

请教一下，我也是生手，我不太看得明白，怎么不能一起染啦，PI做周期用的是线性，FITC、PE这些荧光探针用的是Log通道，不会影响啊。再说，膜表面标记和周期不是一般都不一起做的吗？

fdgg012345

燕仔zoe 发表于 2014-9-23 08:43
请教一下，我也是生手，我不太看得明白，怎么不能一起染啦，PI做周期用的是线性，FITC、PE这些荧光探针用 ...

linear和log只是作图时显示方式不同，跟采集是没有关系的。pi的发射波长比较广，同时占据fl2和fl3两个通道，把pe的通道也占据了。如果你不同时染那就没关系。我要同时染也是因为试验需要啊。