请教一下各位老师细胞表面双标的问题

sendohyozen

各位老师好, 我学流式时间不长,主要做科研的,也只会一些简单的操作,这次实验涉及CD44/CD24两个肿瘤干细胞标记,加药物刺激后啊看表型变化,但该药物本身带荧光, 并且对I,II,III通道都有影响,比较复杂.
这里把我实验里碰到的问题总结一下,请教一下各位老师,望指教,谢谢!
抗体用的是CD44-FITC, CD24-APC,(特意选择波长差比较远的抗体,干扰会小一些) ,仪器是BDcaliur

第一个问题是以前实验也用的BDcalibur的机器，调节FSC用的电压是E00，不知道为什么换这台机器同样型号FSC必须用E-1才能出细胞群，E00很多细胞压线，没法调到图中央，就是普通的MCF7细胞有很大的大小差别吗？
这是FSC/SSC图，用E-1， 不知道怎么做有没有问题？

第二个问题是调节空白补偿的问题，我用的空白细胞调电压，希望可以大部分空白在10^ 0-10^ 1之间, 结果FL1-FL4双标图细胞群比较好看，FL1-FL2图的空白细胞群成一条直线，（药物荧光对第一通道有干扰，所以也设置了药物单染组调节第一通道的补偿，不过后来发现低浓度的药物干扰不大），但是不知道空白细胞成直线是怎么回事？

        
第三个问题是，空白我已经尽量压到10^ 0-10^ 1之间了，再减大部分空白就压线了，结果CD24APC组细胞阳染很明显，部分细胞都压上线了，这怎么办，该做抗体滴定吗？还是我设置的问题，而且APC第四通道应该对一，二通道无干扰吧，结果我这个APC单染的好像对二通道有干扰？


最后附上实验时的调节设置，望各位老师指导，谢谢！第一次做三色荧光，也不知道对不对。

niwanmao

细胞自发荧光是什么波长的？

sendohyozen

niwanmao 发表于 2015-12-21 21:01
细胞自发荧光是什么波长的？

倪老师好! 细胞有自发荧光吗,我用的是普通的MCF7细胞啊?直接用来做空白的, 药物虽然有荧光但我单独设置了单标管的

niwanmao

sendohyozen 发表于 2015-12-21 22:08
倪老师好! 细胞有自发荧光吗,我用的是普通的MCF7细胞啊?直接用来做空白的, 药物虽然有荧光但我单独设置了 ...

我的意思是指你的药物荧光是什么波长？激发和发射

sendohyozen

niwanmao 发表于 2015-12-22 11:01
我的意思是指你的药物荧光是什么波长？激发和发射

这个我没扫过光谱阿, 药物是阿霉素, 488nm激发, 550-600都有吸收, 我做过药物单独在四个通道的吸收,第一,第二,第三通道都有吸收的,第四通道没做.....

niwanmao

你做的细胞是什么类型的细胞来源？一般说来CD44几乎所有造血细胞都表达，而CD24大多数细胞也都高表达（可在http://www.flowcyto.cn/bbs/cluster.php查询）。
至于药物荧光，阿霉素一般在FL2。

sendohyozen

niwanmao 发表于 2015-12-24 20:25
你做的细胞是什么类型的细胞来源？一般说来CD44几乎所有造血细胞都表达，而CD24大多数细胞也都高表达（可在 ...

MCF7 乳腺癌细胞,应该上皮来源.谢谢倪老师.
另外主要想问一下我的FSC/SSC电压是E-1才出细胞群,这正常吗?因为以前用过另一台BDcaliber 用E00就可以出主要的细胞群了,不知道对实验结果又没有影响的?

niwanmao

sendohyozen 发表于 2015-12-24 22:21
MCF7 乳腺癌细胞,应该上皮来源.谢谢倪老师.
另外主要想问一下我的FSC/SSC电压是E-1才出细胞群,这正常吗? ...

电压不同没有关系的，不同仪器，条件本身就不同。

sendohyozen

niwanmao 发表于 2015-12-24 23:07
电压不同没有关系的，不同仪器，条件本身就不同。

好的,谢谢倪老师!