这个结果怎么分析？

ruyudeshui

我想求助一下上面的结果中Marker画的对吗，在空白对照中界定Marker时，阳性率占多少是最适合的？还有我分析结果时应该用半分比还是平均荧光强度啊？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-7-7 19:11

                               
登录/注册后可看大图

我想求助一下上面的结果中Marker画的对吗，在空白对照中界定Marker时，阳性率占多少是最适合的？还有我分 ...

1、设置MARKER的正确对照我个人认为应该是同型对照，而不是空白对照。
2、MARKER设置的位置没有绝对的规定一定要小于百分之多少，我个人的经验是设置于这个曲线顺着下来与x轴交叉点，基本上小于1％。
3、如果你是想比较这两个样本之间的差异，可他们之间的百分比体现不出这个差异时，可以采用平均荧光强度。

ruyudeshui

回复 niwanmao 的帖子

谢谢倪老师，我今天整理数据时发现，有时荧光强度会相差很大，之前同事做的样品平均荧光强度能达到4000多，可是我做的一般都在100以内，不知道跟什么因素有关？我猜想是不是跟设定的仪器条件或是样品制备过程有关，我的样品制备方法如下，请倪老师指点：
   1、将消化下来的细胞，1500r/min，离心3min，弃上清；用PBS洗2次，每次1500r/min离心3min。   
   2、 细胞计数，然后按106/ml密度，1ml细胞悬液/样品，空白对照细胞数稍多；6000r/min，离心30s。
   3、细胞离心后，弃上清，加入100ul 1%BSA-PBS，样品中再加入一抗2 ul, 混匀，  4℃ 放置 30min。
   4、然后每次用1mlPBS洗，6000r/min离心30s，弃上清，共洗3次，；
   5、加入1%BSA-PBS 50倍稀释的FITC标记二抗，混匀，4℃避光30min。
   6、然后加入1ml PBS洗1次, 6000r/min离心30s，弃上清；
   7、最后用400ul PBS重悬细胞过滤上流式细胞仪测定。

不知道我所使用的离心条件和清洗使用的PBS体积是否合适，这两个条件对实验结果影响大吗？

ruyudeshui

回复 niwanmao 的帖子

我还想问如果用平均荧光强度作为阳性指标，那么对同型对照样品的荧光强度有没有要求，比如说要通过调节仪器条件使其小于多少或是处于某个范围？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-7-8 20:43

                               
登录/注册后可看大图

回复 niwanmao 的帖子

谢谢倪老师，我今天整理数据时发现，有时荧光强度会相差很大，之前同事做的样品平均 ...

我的天，你后面几步为什么要用3000和6000转/min的速度，细胞还不死光光？
步骤顺序没问题，但是：
1、离心速度都要调整至1500－2000转/min。
2、抗体的量你需要根据说明书或自己滴定的结果进行调整，要按照细胞量来的。
3、抗体孵育体积一般都是需要100ul的体积，你用1ml的孵育体积会导致抗体浓度不够，结果会出现假阴性。

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-7-8 20:47

                               
登录/注册后可看大图

回复 niwanmao 的帖子

我还想问如果用平均荧光强度作为阳性指标，那么对同型对照样品的荧光强度有没有要求 ...

没有要求.

ruyudeshui

回复 niwanmao 的帖子

谢谢倪老师的指点，但是我检测细胞表面的蛋白，离心使细胞死亡对检测会有影响吗？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-7-10 20:06

                               
登录/注册后可看大图

回复 niwanmao 的帖子

谢谢倪老师的指点，但是我检测细胞表面的蛋白，离心使细胞死亡对检测会有影响吗？ ...

细胞的状态对结果有很大的影响。如果细胞死亡，分解为碎片，这时，就很容易产生非特异性荧光，在散点图上往往表现为对角线上一束。

ruyudeshui

回复 niwanmao 的帖子

哦，倪老师所说的散点图对角线上的一束是像我上传的那个结果的第二个图吗？从我那个结果看是不是细胞死的很多啊？

niwanmao

ruyudeshui 发表于 2011-7-11 18:43

                               
登录/注册后可看大图

回复 niwanmao 的帖子

哦，倪老师所说的散点图对角线上的一束是像我上传的那个结果的第二个图吗？从我那个 ...

是的，这属于非特异性荧光。