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标题: 组织酶消化 [打印本页]

作者: heybibna 时间: 2021-8-5 15:37
标题: 组织酶消化
我做的是肝脏组织用II型胶原酶消化30min后制成单细胞悬液，用碧云天的盒子PI总是染不上色，大约80%细胞没染上色，问了一下技术说是细胞通透性不好，70%乙醇固定了14个小时，还是染不上色，但是用同样的方法做肌肉组织就能染上色，想请教一下，有什么方法可以增加细胞通透性，染上PI？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-6 07:34
你是要做细胞周期？

做细胞周期，你这里的方法应该是有问题的，首先碧云天盒子的PI究竟是不是AV/PI里面的PI，那个浓度非常低，不够，并且不含破膜成份；其次70％的乙醇不是破膜，只能起固定作用。因此，请参考站内资料：
PI检测细胞周期（乙醇固定，Triton X-100打孔）
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html
(出处: 流式中文网)

作者: heybibna 时间: 2021-8-6 10:45

niwanmao 发表于 2021-8-6 07:34
你是要做细胞周期？

做细胞周期，你这里的方法应该是有问题的，首先碧云天盒子的PI究竟是不是AV/PI里面的P ...

是的老师，我是做细胞周期，碧云天盒子说明书上PI染色液的浓度是20x，但是我用这个盒子做肌肉组织的结果能做出来，因为消化下来细胞状态不是很好，用70的乙醇固定完就会有白色絮状物，所以没用乙醇固定就染色了，结果是下面这样的，就是很奇怪G2期比例是0，不明白是什么原因。还有一个问题，就是消化的时候用了0.25%（含EDTA）的胰酶，这会对结果有一定的影响吗？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-6 13:01

heybibna 发表于 2021-8-6 10:45
是的老师，我是做细胞周期，碧云天盒子说明书上PI染色液的浓度是20x，但是我用这个盒子做肌肉组织的结果能 ...

你这个结果也是有问题的，并不是做出来了。
请参考前面给你的protocol做吧。

作者: heybibna 时间: 2021-8-7 09:29

niwanmao 发表于 2021-8-6 13:01
你这个结果也是有问题的，并不是做出来了。
请参考前面给你的protocol做吧。 ...

老师，想问您一下结果具体哪里有问题，因为我现在把所有样本都做了，结果都是类似这样的，有没有可能通过圈门改改善一下结果，或者哪里有问题我能改进一下。

作者: niwanmao 时间: 2021-8-7 10:15

heybibna 发表于 2021-8-7 09:29
老师，想问您一下结果具体哪里有问题，因为我现在把所有样本都做了，结果都是类似这样的，有没有可能通过 ...

原因如下：
1、PE-H/PE-A的粘连体门，你可以去看一下其它地方的图形，从来没有这样画的，也没有这样的分布。
2、假设你这个结果是对的，请问S期为什么是断的，没有S期，细胞是如何到G2/M期的？

综上，你这结果是有问题的。从而推测你的染色步骤是有问题的。

作者: heybibna 时间: 2021-8-7 10:53
本帖最后由 heybibna 于 2021-8-7 10:57 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-7 10:15
原因如下：
1、PE-H/PE-A的粘连体门，你可以去看一下其它地方的图形，从来没有这样画的，也没有这样的分 ...

好的，老师，粘连体那个门是贝克曼仪器工程师教我们这样圈的，我也感觉稍微有点问题，她说把粘连体后面那点散的细胞圈上就会有S期，现在看来结果是不对的，老师我上传一下fcs文件，您能帮忙圈一下吗？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-7 11:13

heybibna 发表于 2021-8-7 10:53
好的，老师，粘连体那个门是贝克曼仪器工程师教我们这样圈的，我也感觉稍微有点问题，她说把粘连体后面那 ...

你看，有没有发现问题所在？
[attach]22152[/attach]

作者: heybibna 时间: 2021-8-7 15:21

niwanmao 发表于 2021-8-7 11:13
你看，有没有发现问题所在？

老师，我按着您这个圈门试了一下，其实我那个G0G1后面那个小峰是粘连体，它后面根本没有S和G2期，所以您判断我染色方法有问题，是这样的吧？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-8 07:48

heybibna 发表于 2021-8-7 15:21
老师，我按着您这个圈门试了一下，其实我那个G0G1后面那个小峰是粘连体，它后面根本没有S和G2期，所以您判 ...

两种可能性：
1、标本确实没有G2和S期，你做的细胞本身就是静止期的细胞。
2、染色问题。

对于初做细胞周期的FLOWER，我的个人建议是，先用已知细胞周期的样本做，条件做稳定了，再做未知的样本，并且还需要同时混入已知细胞周期的样本做为参照物。

作者: heybibna 时间: 2021-8-18 18:35
老师，还要麻烦您看一下，我按照之前您给的方法重新做了一下，肝脏还是染不上色，肌肉还是只有一个峰，您帮忙看一下是因为什么呢？

作者: heybibna 时间: 2021-8-18 18:35
本帖最后由 heybibna 于 2021-8-18 18:39 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-8 07:48
两种可能性：
1、标本确实没有G2和S期，你做的细胞本身就是静止期的细胞。
2、染色问题。

老师，还要麻烦您看一下，我按照之前您给的方法重新做了一下，肝脏还是染不上色，肌肉还是只有一个峰，您帮忙看一下是因为什么呢？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-18 21:43

heybibna 发表于 2021-8-18 18:35
老师，还要麻烦您看一下，我按照之前您给的方法重新做了一下，肝脏还是染不上色，肌肉还是只有一个峰，您 ...

有G2/M峰的，只是比例比较少而已，参考下图这样：
[attach]22176[/attach]

作者: heybibna 时间: 2021-8-19 08:35

niwanmao 发表于 2021-8-18 21:43
有G2/M峰的，只是比例比较少而已，参考下图这样：

老师，肝脏组织还是染不上色，这样该怎么解决呢，用tritonx-100单独进行透膜处理也还染不上色？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-19 14:51

heybibna 发表于 2021-8-19 08:35
老师，肝脏组织还是染不上色，这样该怎么解决呢，用tritonx-100单独进行透膜处理也还染不上色？ ...

肝脏也有，只是非常少，你用modfit都能拟合出来。

作者: heybibna 时间: 2021-8-19 19:21
本帖最后由 heybibna 于 2021-8-19 19:23 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-19 14:51
肝脏也有，只是非常少，你用modfit都能拟合出来。

老师，我用modfit拟合不出来G2期，我没用自动拟合

作者: niwanmao 时间: 2021-8-19 21:49

heybibna 发表于 2021-8-19 19:21
老师，我用modfit拟合不出来G2期，我没用自动拟合

仔细对照我上面的设门，尤其是R2。然后峰的拟合，请用sync wizard将G2/M期的位置定下来。

作者: heybibna 时间: 2021-8-20 08:54
[attach]22179[/attach][attach]22180[/attach]

niwanmao 发表于 2021-8-19 21:49
仔细对照我上面的设门，尤其是R2。然后峰的拟合，请用sync wizard将G2/M期的位置定下来。 ...

老师，想请教一下为什么用sync wizard将G2/M期位置定下来，您是怎么判断这次的峰是G2峰，而第一次那个是没有S期不能跨到G2期的？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-20 09:47

heybibna 发表于 2021-8-20 08:54
老师，想请教一下为什么用sync wizard将G2/M期位置定下来，您是怎么判断这次的峰是G2峰，而第一次那个是没 ...

请仔细学习我前些年录制的教程：
Modfit手动拟合小教程兼答疑
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7193-1-1.html
(出处: 流式中文网)

作者: heybibna 时间: 2021-8-20 16:24
本帖最后由 heybibna 于 2021-8-20 16:25 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-20 09:47
请仔细学习我前些年录制的教程：
Modfit手动拟合小教程兼答疑
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7193- ...

感谢老师一直耐心讲解，我终于圈出来G2期，但是还有一个问题想请教您一下，按这个圈门和拟合方法，之前做的和按您给的流式protocol同一个样本结果我感觉很接近，这两个结果哪一个更接近真实值呢？

作者: niwanmao 时间: 2021-8-22 11:03

heybibna 发表于 2021-8-20 16:24
感谢老师一直耐心讲解，我终于圈出来G2期，但是还有一个问题想请教您一下，按这个圈门和拟合方法，之前做 ...

结果接近就OK了。这个差异是人为的设置造成的，此时，以RCS小者作为优选。

作者: heybibna 时间: 2021-8-22 21:32
本帖最后由 heybibna 于 2021-8-22 21:35 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-22 11:03
结果接近就OK了。这个差异是人为的设置造成的，此时，以RCS小者作为优选。 ...

好的，明白了，谢谢老师，还有一个问题得请教您，我按这个圈门拟合的方法做了肝脏，结果有点不太一样，右边很明显出现了竖线，有一个分组G2期比例太少，不知道是不是前期处理的不太正确导致的，下面是两个分组的圈门图，还有fcs文件，麻烦老师再给看一下

作者: niwanmao 时间: 2021-8-23 08:03

heybibna 发表于 2021-8-22 21:32
好的，明白了，谢谢老师，还有一个问题得请教您，我按这个圈门拟合的方法做了肝脏，结果有点不太一样，右 ...

这条竖线，在其它样本中也有，只不过肝脏明显一些，因为肝脏细胞活力容易受影响，导致异常强的假阳性。

只有你得参考其它样本的范围，设置R2，不要圈太大。

作者: heybibna 时间: 2021-11-6 22:58
本帖最后由 heybibna 于 2021-11-6 23:02 编辑

niwanmao 发表于 2021-8-23 08:03
这条竖线，在其它样本中也有，只不过肝脏明显一些，因为肝脏细胞活力容易受影响，导致异常强的假阳性。

...

谢谢老师前期耐心指导，受益良多，关于实验还有几个问题向您请教一下，[流式protocol] PI检测细胞周期（乙醇固定，Triton X-100打孔）这个方法里面，配好的染液避光能保存多长时间，每次染不了10个样，之前都是避光四度保存，第二天再染效果不太好，细胞染上色的更少了。也试过配置5个样的用量，triton不好控制挂枪头，您这里有什么小技巧吗？下面这个是按之前已经做出来的方法换了个脏器，但是圈出来还是有点问题，麻烦您看一下。

作者: niwanmao 时间: 2021-11-7 08:37

heybibna 发表于 2021-11-6 22:58
谢谢老师前期耐心指导，受益良多，关于实验还有几个问题向您请教一下，[流式protocol] PI检测细胞周期（乙 ...

1、染液成份里面，RNA酶是否已加？
2、细胞是否经过计数？细胞数和染液的比例是否恒定？
这两个因子都会影响染色结果。

至于Triton，可用反向加样法实现准确加样。

作者: heybibna 时间: 2021-11-7 09:55

niwanmao 发表于 2021-11-7 08:37
1、染液成份里面，RNA酶是否已加？
2、细胞是否经过计数？细胞数和染液的比例是否恒定？
这两个因子都会 ...

老师，染色里面RNA酶已加，不过因为RNase不是DNase-free，所以用的是2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分钟这个方法，然后按比例加到染液里的，细胞经过计数，每个样本细胞数大概是1*10的7次方左右，每次都是加了1mlDNA染液这样操作的。

作者: niwanmao 时间: 2021-11-7 18:57

heybibna 发表于 2021-11-7 09:55
老师，染色里面RNA酶已加，不过因为RNase不是DNase-free，所以用的是2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分 ...

如果都按正确步骤做，不会有问题。

作者: heybibna 时间: 2021-11-11 09:07

niwanmao 发表于 2021-11-7 18:57
如果都按正确步骤做，不会有问题。

老师，方法上说取1x10的6 细胞/管，我最后上机是1x10的7细胞，是不是需要增加染液的量？还有一个问题是，我做细胞周期的组织样是用保护液冻存在-80里，然后37度水浴融化以后进行酶消化上机染色的，我想咨询一下这个方法会不会影响染色结果？因为统一上机1w的细胞，最后染上色的数量只有一半左右，所以最后上机2w细胞染上色的才能达到8k-9k，这样做的话能接近真实值吗？麻烦老师啦。

作者: niwanmao 时间: 2021-11-11 10:10

heybibna 发表于 2021-11-11 09:07
老师，方法上说取1x10的6 细胞/管，我最后上机是1x10的7细胞，是不是需要增加染液的量？还有一个问题是， ...

我没看懂，你这里究竟上机获取的细胞量是1×10E7还是2万？

作者: heybibna 时间: 2021-11-11 11:10

niwanmao 发表于 2021-11-11 10:10
我没看懂，你这里究竟上机获取的细胞量是1×10E7还是2万？

细胞计数是1×10E7，上流式细胞仪的数量是2w

作者: niwanmao 时间: 2021-11-12 09:52

heybibna 发表于 2021-11-11 11:10
细胞计数是1×10E7，上流式细胞仪的数量是2w

这样有点浪费细胞的，1000万只取了2万细胞。
从分群看，应该是可以，但是可能你们的仪器产生的数据不太适合Modfit分析。
以后做，可以只用100万细胞试试，让染色充分一点。

作者: heybibna 时间: 2021-11-13 08:53

niwanmao 发表于 2021-11-12 09:52
这样有点浪费细胞的，1000万只取了2万细胞。
从分群看，应该是可以，但是可能你们的仪器产生的数据不太适 ...

老师，我之前做的统一上2w细胞，染上7，8千分析的结果可以用吧，我们的仪器是beckman cytoflex s这个仪器，自带的分析软件分析结果必须手动分析，感觉误差比较大。那之后做如果细胞数目太多，我可以稀释成100万，然后体系还是1ml染液吗？

作者: niwanmao 时间: 2021-11-13 19:26

heybibna 发表于 2021-11-13 08:53
老师，我之前做的统一上2w细胞，染上7，8千分析的结果可以用吧，我们的仪器是beckman cytoflex s这个仪器 ...

统一100万细胞，乙醇固定过夜后，离心去上清，并洗涤一次，然后再加入1ml染液，上机低速获取。
2万个细胞是至少，如果能多获取一些最好。

作者: heybibna 时间: 2021-11-15 11:20

niwanmao 发表于 2021-11-13 19:26
统一100万细胞，乙醇固定过夜后，离心去上清，并洗涤一次，然后再加入1ml染液，上机低速获取。
2万个细胞 ...

好的，老师，获取细胞数量多少会对周期结果有影响吗？还是所有样本做到统一就ok?我记得modfit分析，这个Cell#，指的是用于拟合分析的细胞数，不能少于 10000 个。

作者: niwanmao 时间: 2021-11-15 16:22

heybibna 发表于 2021-11-15 11:20
好的，老师，获取细胞数量多少会对周期结果有影响吗？还是所有样本做到统一就ok?我记得modfit分析，这个 ...

一般建议是>2万

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