小鼠外周血中性粒细胞流式检测

菜根谭

                               
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以上是中性粒细胞裂红后的流式细胞图，R4是CD45+CD11b+Gr-1hi的中性粒细胞。
1.小鼠眼眶取血，由于实验室没有肝素抗凝，我采用的是EDTA抗凝，不知是否会对流式分析产生影响？
2.FSC-SSC中，红色圈出的P1门是否能完全代表活细胞？是否应该把左下角的那一群细胞也圈出来？
3.采用anti-Ly6G抗体去耗竭中性粒细胞后，为何48后，虽然R4门中性粒细胞比例确实下降了，为何R5的比例会增加那么多？
以上是我的一些问题，忘各位老师不吝赐教，谢谢！

niwanmao

在回答之前，先提一个建议，以后做流式图，请尽量将坐标名称都标记为抗体名称，方便他人理解。

1、EDTA抗凝，一般不会有影响。
2、P1门可代表活细胞，左侧是碎片。
3、Ly6G耗竭后，R5内的细胞，应该仍然是粒细胞，只不过发生了Gr-1的下调。我不知道你的实验步骤是什么样的，是在体内耗竭还是体外？

菜根谭

niwanmao 发表于 2021-2-17 12:01
在回答之前，先提一个建议，以后做流式图，请尽量将坐标名称都标记为抗体名称，方便他人理解。

1、EDTA抗 ...

倪老师你好，这是我的实验步骤，请倪老师帮我看一下，望老师能批评指正，提出宝贵建议！
1. 首先给荷4T1肿瘤的小鼠腹腔注射anti-Ly6G抗体 250微克 耗竭中性粒细胞
2.分别在耗竭中性粒细胞前、耗竭中性粒细胞24h，48h眼眶采血100微升静脉血，EDTA抗凝
3.索莱宝的红细胞裂解液裂解两次，分别裂解15min和5min
4.CD45-PE、CD11b-FITC、Gr-1-APC抗体，4度孵育30min
5.PBS清洗两遍上流式

我想再请教倪老师：
1.CD16/32非特异性抗体封闭是不是必须的？
2.如果中性粒细胞耗竭之后，部分中性粒细胞的Gr-1biaoda1下调，那我是否需要引入另外一个Maker，比如F4/80或者Ly6C来判断中性粒细胞实际的耗竭效果？请问引入哪一个maker会更好一些呢？我采用的流式仪器是BD-C6
感谢老师，期待你的回复！

niwanmao

菜根谭 发表于 2021-2-18 10:12
倪老师你好，这是我的实验步骤，请倪老师帮我看一下，望老师能批评指正，提出宝贵建议！
1. 首先给荷4T1 ...

1、阻断还是建议尽量做上去，尤其是粒细胞和单核细胞染色时。
2、下调，其实目前的标记也够了，你可以对比耗竭前后的图，淋巴细胞的Gr-1水平，耗竭后也出现明显降低，这说明了什么？说明耗竭前的非特异性染色比较明显，所以我的建议是先将染色做好吧。但从目前的比例来看，似乎有一定效果，但不是很明显。

菜根谭

niwanmao 发表于 2021-2-18 12:37
1、阻断还是建议尽量做上去，尤其是粒细胞和单核细胞染色时。
2、下调，其实目前的标记也够了，你可以对 ...

好的，谢谢老师，请问上述中性粒细胞耗竭之后Gr-1表达下调是与我的流式非特异性染色有关是吗？除了增加CD16/32的阻断，我还可以进行哪些条件优化呢？

半年y

为啥要检测Gr-1呢，不能检测Ly6G吗？