贴壁细胞PI（碘化丙啶）染色操作视频

niwanmao

贴壁细胞PI（碘化丙啶）染色的操作视频，从细胞的消化到染色，每个细节都完整详细地呈现在我们眼前。
视频转自abnova公司。

视频截图10幅：
1、吸掉培养基后，用PBS洗涤


2、加入胰酶


3、消化完毕，加入PBS洗下细胞


4、离心


5、去上清


6、0.3ml PBS重悬


7、加入0.7ml纯乙醇（最终乙醇浓度70％），－20℃作用20分钟


8、去除乙醇


9、加入500ul RNase（浓度200ug/ml），作用30分钟


10、加入500ul PI（终浓度50ug/ml）孵育30分钟（避光）。最后上机。




视频观赏见下（通过实名认证的站友可见）：

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椴树

niwanmao 发表于 2015-6-26 21:19
RFP没用过，查了下发射波长是580nm，而PI是620nm，可能在beckman仪器上还是可以调节的，BD可能比较困难。 ...

老师，我已经解决了，因为我只是转染了RFP进去细胞，在分析周期时并不需要分析RFP，所以我用乙醇固定24h后，分别加PI和不加PI，发现不加的话PI是检测不到信号的，RFP应该如你另一篇帖子说的，荧光蛋白溶出细胞外了（上回转了GFP，检测周期结果也测不到GFP，本来不知道怎么回事，现在知道了应该也是溶出去了）。但是在查乙醇固定的原理，没有找到，如果是为了打洞的话，染液中不是加入了Triton了么？想知道乙醇固定的原理，为什么乙醇固定就会溶出细胞，甲醛固定就不会。

zyfreely

学习下，正好要用到这个

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-21 12:19
老师好，如果用PI或者DAPI染死细胞，会影响哪些颜色？哪些颜色的抗体不能用？ ...

PI其实有点复杂，从下图看，会在488和紫外两个波段下都会激发，然后发射光也可以在大多数的FL2和FL3都能检测到。但DAPI简单些，紫外光激发，发射光大约在460nm左右。

jiangmeng

niwanmao 发表于 2015-6-26 21:19
RFP没用过，查了下发射波长是580nm，而PI是620nm，可能在beckman仪器上还是可以调节的，BD可能比较困难。 ...

老师好，如果用PI或者DAPI染死细胞，会影响哪些颜色？哪些颜色的抗体不能用？

cl小陈

niwanmao 发表于 2016-6-16 15:12
居然如此，更不应该同步了。
检测细胞周期，你说的这两样都不需要。

好的，多谢老师，我下次会注意的

niwanmao

cl小陈 发表于 2016-6-15 21:10
单纯看药物诱导凋亡后，细胞周期的变化，细胞凋亡阻滞在哪一期；
另外：1.上清夜需要收集吗？2.消化贴壁 ...

居然如此，更不应该同步了。
检测细胞周期，你说的这两样都不需要。

PS：要提问，建议开新帖，否则容易造成帖子主题偏离，下不为例，谢谢。

cl小陈

niwanmao 发表于 2016-6-14 13:22
你自己的检测目的是什么？

单纯看药物诱导凋亡后，细胞周期的变化，细胞凋亡阻滞在哪一期；
另外：1.上清夜需要收集吗？2.消化贴壁细胞是需用含EDTA的胰酶还是不含EDTA的胰酶，我看网上说法不一，试剂盒上只说明消化收集细胞。
谢谢老师啦~~

niwanmao

cl小陈 发表于 2016-6-13 17:52
老师您好，我看有的资料说，检测细胞周期时，1.需要同步化细胞，2.诱导细胞后处理时，细胞培养基和清洗的PB ...

你自己的检测目的是什么？

cl小陈

老师您好，我看有的资料说，检测细胞周期时，1.需要同步化细胞，2.诱导细胞后处理时，细胞培养基和清洗的PBS都还要收集一并离心，；我想听听老师您的意见？

杨敏

niwanmao 发表于 2015-11-30 21:44
我看到的是25µg/ml 7AAD，跟rna会有交叉，仅供参考。

倪老师，我在wiki上查到的是7-Aminoactinomycin D (7-AAD) is a fluorescent chemical compound with a strong affinity for DNA. It is used as a fluorescent marker for DNA in fluorescence microscopy and flow cytometry. It intercalates in double-stranded DNA, with a high affinity for GC-rich regions,making it useful for chromosome banding studies。7aad是不是之作用于DNA啊？