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1.17 W niwanmao 管理组


贴壁细胞PI(碘化丙啶)染色的操作视频,从细胞的消化到染色,每个细节都完整详细地呈现在我们眼前。
视频转自abnova公司。

视频截图10幅:
1、吸掉培养基后,用PBS洗涤

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2、加入胰酶

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3、消化完毕,加入PBS洗下细胞

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4、离心

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5、去上清

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6、0.3ml PBS重悬

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7、加入0.7ml纯乙醇(最终乙醇浓度70%),-20℃作用20分钟

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8、去除乙醇

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9、加入500ul RNase(浓度200ug/ml),作用30分钟

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10、加入500ul PI(终浓度50ug/ml)孵育30分钟(避光)。最后上机。

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有 26 条回复

推荐 椴树 LV2

引用: niwanmao 发表于 2015-6-26 21:19
RFP没用过,查了下发射波长是580nm,而PI是620nm,可能在beckman仪器上还是可以调节的,BD可能比较困难。 ...

老师,我已经解决了,因为我只是转染了RFP进去细胞,在分析周期时并不需要分析RFP,所以我用乙醇固定24h后,分别加PI和不加PI,发现不加的话PI是检测不到信号的,RFP应该如你另一篇帖子说的,荧光蛋白溶出细胞外了(上回转了GFP,检测周期结果也测不到GFP,本来不知道怎么回事,现在知道了应该也是溶出去了)。但是在查乙醇固定的原理,没有找到,如果是为了打洞的话,染液中不是加入了Triton了么?想知道乙醇固定的原理,为什么乙醇固定就会溶出细胞,甲醛固定就不会。

2楼 resurgam LV2

学习了。谢谢!

3楼 PeteM LV2

弱弱的问,这个PI染色目的是啥实验?

4楼 niwanmao 楼主

引用: PeteM 发表于 2015-5-6 10:30
弱弱的问,这个PI染色目的是啥实验?

检测细胞周期

5楼 PeteM LV2

引用: niwanmao 发表于 2015-5-6 10:32
检测细胞周期

老师,谢谢您的回答,我同学最近做了一个实验需要染活死细胞,就染了PI 15分钟然后洗掉上机,发现PI 通道 unstained 的细胞 直方图 与染了PI的直方图 都只有一个 峰,只是染 PI 的 直方图 PI 峰 相对 与 unstained 的峰 向前 了一些,这是怎么回事?非常感谢您的回答

6楼 niwanmao 楼主

引用: PeteM 发表于 2015-6-23 15:28
老师,谢谢您的回答,我同学最近做了一个实验需要染活死细胞,就染了PI 15分钟然后洗掉上机,发现PI 通道 ...

染死活细胞的话,PI浓度要低,并且在上机前两三分钟染,染完直接上机,不能洗涤。

PS:下次建议开新帖提问,谢谢。

7楼 椴树 LV2

引用: niwanmao 发表于 2015-6-23 17:38
染死活细胞的话,PI浓度要低,并且在上机前两三分钟染,染完直接上机,不能洗涤。

PS:下次建议开新帖提 ...

老师,请问我的细胞本身表达GFP和RFP,我想检测细胞周期,可以用PI么?有什么解决方案么?

8楼 niwanmao 楼主

引用: 椴树 发表于 2015-6-26 15:10
老师,请问我的细胞本身表达GFP和RFP,我想检测细胞周期,可以用PI么?有什么解决方案么? ...

RFP没用过,查了下发射波长是580nm,而PI是620nm,可能在beckman仪器上还是可以调节的,BD可能比较困难。

如果有紫外激光,可以试试DAPI或者Hoechst染料看看;如果没有,可以试试DRAQ5

10楼 sendohyozen LV2

老师您好!弱问一下,这实验我也马上要做了,以前做过峰形很难看,看视频PI这是不用洗直接上机吗?RNase也不用洗?
我以前洗着洗着 细胞都没了,好像固定后的细胞不太好离心下来的样子.....
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