MFI值如何对其进行标准化

张务龙

您好，我检测的指标的表达量很低，因此我想用该指标的MFI值作为显示它表达量高低的标准可以吗？如果我用MFI值进行产品注册，如何对MFI值进行标准化？那对于购买我的标记抗体试剂来说，他们买家的仪器也是不一样的，如何确保我们的MFI值做出的参考区间准确？

hurunhuan

MFI可以显示表达量高低。如果用MFI注册的话，建议使用已知MESF的微球标准品来定标，然后样本中加入微球标准品，将MFI数值转化为MESF值，就可以标准化数值了。如果是PMT仪器，大部分情况样本中可以不用添加微球标准品来算MESF，但是如果是APD的仪器，或者是信号做过处理的PMT仪器，建议每个样本中加微球标准品，分别计算标曲。

niwanmao

1. 在仪器的线性检测范围内，MFI 与标记抗体所结合的靶分子数量通常呈近似线性关系。所以要使低表达指标检测结果准确，一定要确保所选荧光染料（如 PE、APC）和 PMT 电压设置能把信号推到仪器的线性区间内，避免因过低而落入噪声，也避免因过高而饱和。

由于表达量低，更要严格做阴性对照（未染色／同型对照）来扣除背景荧光，并推荐使用 ΔMFI（样本 MFI–阴性对照 MFI）或 Fold-change（样本 MFI／阴性对照 MFI）来表达信号强度，降低不同实验批次间的偏差。

2、要适配不同仪器，建议进行MFI 标准化，即转化为国际／仪器无关的单位。一般利用校准微球，选用 MESF（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome）或 ERF（Equivalent Reference Fluorochrome）校准微球。
每次检测前，先测量一套已知 MESF 值的标定珠系列，绘制 MFI–MESF 标准曲线。接着，样本在同次检测中得到的 MFI，代入标准曲线即可转换成 MESF，成为仪器无关的“绝对”荧光强度单位。

3、每次做之前，都要用校准微球确认仪器状态

hurunhuan

niwanmao 发表于 2025-4-29 08:51
1. 在仪器的线性检测范围内，MFI 与标记抗体所结合的靶分子数量通常呈近似线性关系。所以要使低表达指标检 ...

倪老师，MFI–MESF 标准曲线是跟电压（PMT）或者增益（APD）相关的，不同的电压或者增益下，曲线是不能类比的哦。并且PMT仪器每天都会有个位数的电压漂移，每天APD的增益变化会略大一点，而且有些仪器是同一管样本连续测10次，次次不一样，MFI能差到+-3SD以上。所以如果追求比较精确一点，在不影响染色的情况下，每个样本里加校准微球，每次都计算曲线是最保险的了。计算的话，FCS数据，可以直接写个软件计算，非常方便，计算量也是非常小的。

niwanmao

hurunhuan 发表于 2025-4-29 09:07
倪老师，MFI–MESF 标准曲线是跟电压（PMT）或者增益（APD）相关的，不同的电压或者增益下，曲线是不能类 ...

连续测10次CV这么大，这个仪器是不是得认为不合格呀

张务龙

谢谢各位老师的建议，我这边去查查微球的资料。

hurunhuan

niwanmao 发表于 2025-4-29 10:12
连续测10次CV这么大，这个仪器是不是得认为不合格呀

仪器合不合格不是实验员说了算的，也不是质检说了算的，是公司领导说了算的。验不出合格不准下班，无论哪个质检来验收仪器，仪器都是百分百合格的。