健康人外周血B细胞检测出现CD3+CD19+的群体

maomao

近期遇到一个解释不通的流式B细胞检测问题，使用的是先裂解后染色的操作步骤，裂解15分钟，200g 离心5min，使用抗体为CD45-V500，CD3-BV421，CD19-BB515，CD20-Alexa Fluor 700的4色Panel，抗体避光孵育15min，洗第一次后上机，荧光之间的补偿是没有问题的哈，设门逻辑是：先去黏连，然后圈出CD45+淋巴群体，再横纵坐标看CD3/CD19圈出B细胞，到这里的结果是有CD3+CD19+的群体出现，看到结果后实属惊讶，也不清楚问题所在（换过两家不同的裂解液，都是专门用来先裂后染的），看看哪位大佬能给解释下原因的？实验过程中该怎么解决？

maomao

补充图

Yuck

克隆号有没有抑制或者竞争呢。

maomao

Yuck 发表于 2025-6-12 13:42
克隆号有没有抑制或者竞争呢。

CD45克隆 HI30，CD20克隆 2H7，CD19克隆 HIB19，CD3克隆 SP34-2  这些之间会有这关系？我的解答是：对于克隆 2H7 (CD20) 和 HIB19 (CD19)，它们是流式细胞术中非常经典且常用的组合，广泛应用于B细胞设门（如CD19+CD20+）。大量实验数据和商业化的多色抗体组合（如BD Biosciences的套装）都证明它们可以完美地同时使用，没有直接的竞争或抑制报告。HI30 (CD45) 和 SP34-2 (CD3) 也是流式中极其常用的克隆号，与B细胞标志物组合使用没有任何问题，所以我觉得应该不是这个原因，谢谢。

niwanmao

BV421和BB515是第一次搭配使用？以前在这台仪器上用过相似的组合吗？

另外，这台仪器的光路和滤光片结构配置如何？

Yuck

maomao 发表于 2025-6-12 14:08
CD45克隆 HI30，CD20克隆 2H7，CD19克隆 HIB19，CD3克隆 SP34-2  这些之间会有这关系？我的解答是：对于 ...

1、看图的话，CD3-CD19-那一大群不对，所以怀疑是抗体克隆号的影响，建议加个CD4+、CD8+看一看CD3+与CD3+CD4+/CD3+CD8+的比例是否大致符合。2、印象中看过类似的中文检验期刊，如果样品中含有高浓度的免疫球蛋白会干扰实验需要用PBS清洗样品来解决。

maomao

niwanmao 发表于 2025-6-12 19:34
BV421和BB515是第一次搭配使用？以前在这台仪器上用过相似的组合吗？

另外，这台仪器的光路和滤光片结构配 ...

倪老师，仪器是BD FACSCanto II PLUS  3激光10色，设备配置是完全没有问题的哈

maomao

Yuck 发表于 2025-6-13 08:15
1、看图的话，CD3-CD19-那一大群不对，所以怀疑是抗体克隆号的影响，建议加个CD4+、CD8+看一看CD3+与CD3+ ...

您好！这个是先裂解红细胞再染色的，期间裂解完会离心去上清，还有一次洗涤后再加抗体的，所以这个原因是不是可以排除？

Yuck

maomao 发表于 2025-6-13 08:43
您好！这个是先裂解红细胞再染色的，期间裂解完会离心去上清，还有一次洗涤后再加抗体的，所以这个原因是 ...

去上清了那应该也不是这个原因。那得从新梳理找找了。发完整流程吧。仪器、样品来源、操作流程。

niwanmao

maomao 发表于 2025-6-13 08:41
倪老师，仪器是BD FACSCanto II PLUS  3激光10色，设备配置是完全没有问题的哈

这两个荧光素搭配以前在其它抗体上有没有搭配用过？

只看图形，感觉应该是可以调过去，但是Spreading  Error很大，所以还是需考虑荧光素搭配问题

BB515和BV421都是他们主推的，理论上不会有问题，但具体到某几个抗体和某台机器，或许就存在偶发问题