求流式大佬指教！公司做的大鼠脾脏样本Th17细胞比例结果异常，CD3阳性分群不明显

叮咚叮咚买菜

动物：Wistar大鼠
①脾脏样本结果（图见标号a1）CD3阳性细胞分群不明显，公司对此的解释是死活染料的通道有轻微干扰CD3染料可能导致分不太开，我想问这样的结果是不是完全不可靠呢（会被审稿人质疑）？可以通过补偿或者其他方式调整结果，让其分群更明显嘛？（目前我手上没有备用的样本，是否可以买一批鼠搞FMO呢？）
②我查询到的文献中空白组Th17细胞的比例大多数都在0.5%-2%之间，但公司做出来的空白组已经达到了10%了，对此公司的解释是文献中的比例是占总细胞数量的，他们给的报告里都是占父群的比例，请问各位大佬是这样嘛？如果不是这样的话，为什么做出来的结果会如此高呢？（因为文献大多数只展示最后一张十字架图，小白看不出来到底分母是父群还是总细胞群）
补充：看了公司报告中Th17占总细胞数量的比值确实是在0.5%-2%左右，请问这是否与CD3阳性细胞群无明显分群有关呢（无明显分群导致CD3阳性细胞群圈出来的量过少，分母变小，比值变大？）如果是这样的话，我最终要看Th17/Treg细胞的比例，我可否用Th17占总细胞数量的比值除以Treg占总细胞数量的比值呢？
③同样的流式染色和圈门方法为何全血的分群要更明晰一点呢？（图见标号a2）
纯小白，如果问出了很蠢的问题请各位多多包涵，目前就这两个地方觉得困惑，辛苦各位大佬再帮忙看看有什么别的问题呢？

空白组脾脏样本结果

空白组脾脏样本结果

空白组全血结果

空白组全血样本结果

niwanmao

从空白组看，死细胞较多，但CD3有分群。空白组Live/dead染料把很多死细胞都圈进去了。

结合空白组的强度，反观实验组，就可见细胞全死了。

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niwanmao 发表于 2025-11-20 19:05
从空白组看，死细胞较多，但CD3有分群。空白组Live/dead染料把很多死细胞都圈进去了。

结合空白组的强度， ...

①非常感谢倪老师给予指导！！！可能我说明的不清晰。我这两组图片都是空白对照组的结果。
a1是空白对照组标号为a1的大鼠的脾脏染色结果；a2是空白对照组标号为a2的大鼠的外周血染色结果。所以我这里并没有实验组，可以再烦请您看看到底哪里出问题了嘛？

②倪老师您说我的死活染料圈门把很多死细胞圈进去了，请问我具体应该怎么圈呢？我没有看到明显的分群，无从下手

叮咚叮咚买菜

叮咚叮咚买菜 发表于 2025-11-20 23:49
①非常感谢倪老师给予指导！！！可能我说明的不清晰。我这两组图片都是空白对照组的结果。
a1是空白对照 ...

另外，还有一点老师我忘了说。两组图片都是空白对照组，我主要疑惑的是为什么外周血样本CD3+有明显分群，而脾脏样本的CD3+却没有分群，有没有什么方法补救呢？

niwanmao

叮咚叮咚买菜 发表于 2025-11-20 23:49
①非常感谢倪老师给予指导！！！可能我说明的不清晰。我这两组图片都是空白对照组的结果。
a1是空白对照 ...

哦，仔细看了图注，明白了

全血死细胞>50％，但是有活细胞，故CD3分群较好

脾脏几乎全死，所以CD3分不出，均为非特异性

全血本身就是单细胞，故处理后活率高。脾脏等组织的处理是有较高技术要求的，所以说明样本处理有问题

102835

这是哪家公司做的啊，这也太糊弄人了吧

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niwanmao 发表于 2025-11-21 07:49
哦，仔细看了图注，明白了

全血死细胞>50％，但是有活细胞，故CD3分群较好

非常感谢倪老师回复！今天公司把Treg的结果发给我了，我看a1大鼠的脾脏Treg结果分群却比较清晰，是同一只鼠的脾脏分成两管染的色，这会不会说明不是脾脏细胞活性的原因呢？

a1大鼠脾脏Treg

a1大鼠Treg十字架圈门

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102835 发表于 2025-11-21 17:22
这是哪家公司做的啊，这也太糊弄人了吧

您好，请问我的全血样本a2（分群比较好的）那个结果是否可信呢？

司徒随风

叮咚叮咚买菜 发表于 2025-11-22 11:21
非常感谢倪老师回复！今天公司把Treg的结果发给我了，我看a1大鼠的脾脏Treg结果分群却比较清晰，是同一只 ...

一个死活主群在10^4一个在10^3,这是同一个脾脏，我挺好奇他们是怎么做到的。难道是上机参数不一样吗，那这样别人怎么分析。

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司徒随风 发表于 2025-11-22 11:38
一个死活主群在10^4一个在10^3,这是同一个脾脏，我挺好奇他们是怎么做到的。难道是上机参数不一样吗，那这 ...

您好，我纯纯是流式小白，有什么离谱发言希望您别见怪。因为是同一个脾脏，分为两管分别测定Th17细胞比例和Treg细胞比例，所以我猜想这两管的上机参数可能不一样？
另外，请您指导我一下，由于第一行图片中展示的脾脏Th17细胞的死活和CD3+细胞分群不明显，我是否能够按照Treg死活主群的10^3直接区分不明显分群的Th17细胞的死活呢？