流式细胞术的“光谱革命”，解析算法和柯达的启示

niwanmao

以下内容，节选并改编自：J. Paul Robinson, Bartek Rajwa,
Chapter Thirteen - Spectral flow cytometry: Fundamentals and future impact,
Editor(s): J. Paul Robinson, Pratip K. Chattopadhyay, James W. Jacobberger,
Methods in Cell Biology,
Academic Press,
Volume 186,
2024,
Pages 311-332,
ISSN 0091-679X,
ISBN 9780323994194,
https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2024.02.022.
(https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0091679X24000530)

从“滤色片”到“光谱仪”：思维的彻底转变

传统（多色）流式与光谱流式的核心区别，在于看待光信号的方式。

多色流式试图避免光谱重叠。它使用复杂的滤光片系统，努力将不同染料发出的光引导到不同的探测器上，理想状态是“一个染料，一个探测器”。然而，这不可能完美实现，总有信号损失和串扰。就像图1所示，大量落在滤光片通带之外的荧光信号被丢弃了，而这些信号本可能携带重要信息。

光谱流式则坦然接受光谱重叠是不可避免的物理现象。它不再试图用硬件强行分离光信号，而是采用了一种全新的设计：收集每个细胞发出的全波段荧光光谱，然后通过数学算法“解混”，计算出每种荧光染料的贡献量。

这就像不再用几块彩色玻璃看画，而是用光谱仪扫描整幅画，记录下每个像素点的完整光谱信息，再通过计算分离出原始颜料成分。

当柯达错过数码相机：技术变革的启示

光谱流式的发展并非一帆风顺。它的故事让人联想到另一个行业巨头的教训——柯达。

1975年，年轻的柯达工程师史蒂夫·萨森发明了第一台数码相机原型。然而，柯达管理层认为“没人会想在电视屏幕上看照片”，担心数码技术会冲击其庞大的胶卷业务，因此将这项革命性发明束之高阁。尽管坐拥大量专利，但决策的短视最终导致柯达在2012年破产。

光谱流式技术最初也面临类似的冷遇。科学界和商业公司习惯了成熟的多色流式体系，对改变持谨慎态度。然而，其内在的技术优势最终证明了价值。自2013年第一台商用光谱流式细胞仪问世以来，至今已有约1500-2000台设备投入使用，标志着它正从新兴技术走向主流。

“解混”算法如何拨开迷雾

光谱流式强大的背后，是精密的数学“解混”算法。要理解它，我们需要先看看传统多色流式如何做“补偿”。

在多色流式中，每个探测器测到的信号，其实是所有染料信号的混合。这个过程可以用一个简单的线性方程表示：

f = M a

这里，f 是探测器测到的信号向量，a 是每种染料的真实荧光量（我们想知道的），而 M 就是“spectral overlap matrix”，它描述了每种染料的光谱会如何泄露到各个探测器。

传统补偿，就是在已知 M 的情况下，求它的逆矩阵，然后计算 a = M⁻¹ f。但这有一个前提：探测器数量和染料数量必须严格相等（即 M 是方阵）。

光谱流式打破了这一枷锁。它的探测器通道数（比如32或48个）远多于使用的染料数量。因此，其数学模型变为：

f = M a + e

这里，M 变成了一个“高瘦”的矩阵（行数多于列数），它更像一个记录了每种染料完整光谱特征的“光谱库”。e 代表了测量中不可避免的“噪声”或误差。

由于方程不再有唯一的精确解，我们需要用更聪明的数学方法去估计最可能的 a。

1、最小二乘法：基础但有限

• 最简单的方法是寻找使预测信号与实际信号差异最小的解。但这个方法假设噪声是高斯分布，且可能产生无意义的负值。
  

2、更真实的噪声模型

• 实际上，荧光发射和探测是随机过程，噪声更符合泊松分布（光子计数）或负二项分布（超泊松离散）。基于这些模型的最大似然估计，能获得更准确、更符合物理现实的解。
  

3、加入先验知识——正则化

• 我们还可以把已知信息融入计算。例如，我们知道荧光量不能为负（非负约束），或者某些标记物在某些细胞上很可能不表达（稀疏性约束，如LASSO）。这种方法被称为正则化，能显著提高解混的准确性和稳定性。
  

通过这种更复杂的解混，光谱流式不仅能得到更准确的定量结果，还能减少细胞群体的数据扩散，使细胞亚群的分群更清晰、可视化效果更好。