磁珠分选有没有特别的注意事项？

samly0

钢蛋儿 发表于 2014-6-29 22:11
请问分选人外周血CD4+ T细胞建议阳选还是阴选？只有2*10^7个细胞是不是应该选择MS柱子？美天旎和stem cel ...

阴选还是阳性要看你想用几种mark标记来分选你要的细胞，如果只需要CD4阳性表达的细胞，阳性比阴选效果好，如果需要分选两个或以上mark分子阳性表达的话，需要先阴选再阳性。我喜欢用LD柱，分选细胞快，没那么容易堵，除了大小的区别，我不清楚MS柱和LD柱还有啥区别，这个要问美天旎的技术支持。用过美天旎的，stem cell没用过，不过看说明这个更简单方便。

钢蛋儿

samly0 发表于 2014-6-30 08:49
阴选还是阳性要看你想用几种mark标记来分选你要的细胞，如果只需要CD4阳性表达的细胞，阳性比阴选效果好 ...

谢谢！下面我在网上找到的关于磁珠分选的一点比较~
网上说由于阳性分选得到的细胞表面结合有抗体及磁珠，有可能影响细胞的功能，故目前常用阴性分选的方法分离细胞。如果只能用阳性分离的方法建议在分离后培养1-2天，使结合在细胞表面的抗体脱落。不知道阳选CD4+细胞后培养1~2天是如何培养？您对阳选后磁珠的去除有经验吗？谢谢哦

samly0

我们分选后加不同的细胞因子刺激，可以诱导CD4+增殖分化成不同细胞亚群，如Treg，TH17，不加刺激的原代T淋巴细胞很难存活生长下去，我当时没觉得磁珠会影响细胞的分化和增殖，倒是觉得从原代细胞分离到分选结束的时间太长对细胞的活性影响比较大。

FCMao

我觉得分选，最关键的还是单个核细胞要提好，你之前做过吗。水平离心，温度，这些细节都注意了吗？另外标记前，细胞悬液过300目滤膜，防止杂质成分堵柱子。

957615122

samly0 发表于 2014-7-1 08:31
我们分选后加不同的细胞因子刺激，可以诱导CD4+增殖分化成不同细胞亚群，如Treg，TH17，不加刺激的原代T淋 ...

samly0老师，您好！我最近准备做naive CD4细胞诱导分化成Th17细胞，看文献诱导所加的细胞因子不太一致，不知道您都加什么细胞因子呢？
IL-6，IL-23，TGF-beta，anti-IFN-gamma,anti-IL-4这些可以吗？

antoria

FCMao 发表于 2014-7-8 20:17
我觉得分选，最关键的还是单个核细胞要提好，你之前做过吗。水平离心，温度，这些细节都注意了吗？另外标记 ...

你好，我想问一下你说的滤膜是什么？我做CD3+T分选，每次过柱子后，细胞就很少，不明原因。

niwanmao

antoria 发表于 2015-5-28 17:13
你好，我想问一下你说的滤膜是什么？我做CD3+T分选，每次过柱子后，细胞就很少，不明原因。 ...

这种滤网是普通的工业筛网，防止细胞团块形成。

mengdecao

samly0 发表于 2013-6-8 15:59
阴选的纯度很难达到阳选那么高的，你的抗体量是按说明书的比例足量给不？你再过一遍柱子看看纯度会不会高 ...

磁珠阳选后细胞的纯度达到了98－100%，理论上是可行的。请问分选后，你是如何测其纯度的？洗脱后细胞你是否除去了磁珠？再用相应抗体（如CD3）染后上机吗？

mengdecao

阳选的细胞纯度不高是合理的。因为有磁珠占位。或许你应该除去磁珠之后，再与相应抗体incubation and staining， 这样你的纯度就会上升。阴性选择所得的细胞流式测得的纯度都很高。这是我的经验。

小憨

各位老师提到的各项注意事项都非常受用，受益匪浅！
我也贡献几个小贴士吧，自己做MACS的体会：
1. 如果用美天旎的kits，那就得用buffer。buffer的pH非常重要，有一段时间我做MACS纯度一直特别低，也找不到其他原因，后来一测pH值，5点多，太酸了！把pH调回去再用，纯度就上去了。
2. 细胞悬液的质量也特别重要，如果其中含有较多死细胞、组织碎片的话，会影响抗体结合，降低纯度或得率。尤其是组织中的脂类物质，简直是太讨厌了……

PS：我还想请教个小问题，如果两个磁铁挨的特别近，会不会影响相互影响磁场，造成纯度的降低啊？