请各位大侠们 CD3/CD28共刺激小鼠脾脏细胞（CFSE检测）

pushiming77

大家好，我做了很多次 CD3/CD28共刺激小鼠脾脏细胞（CFSE检测）这个实验，在显微镜下可以明显的看到细胞的增殖，但是在流式上检测，出现地增殖峰一点儿都不明显。我用的是96孔板，每孔20w脾脏细胞。CD3/CD28用的浓度为0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml。用BDVerse检测的。CFSE用量是10μM，1.0*10^7，10分钟常温染色，5分种冰浴终止，洗3次。培养72小时。

但是，有做过一次，增殖峰比较明显的（其实也不知道是不是增殖峰）

niwanmao

mybiosciences 发表于 2013-6-24 11:51

                               
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是不是浓度太高了，看过一篇文献，1.0*10^7细胞，CFSE用量是1μM，20℃，染色5分钟
...

这条件确实很难摸，要在细胞死亡和增殖之间找到一个细胞密度、CFSE浓度两个指标的均衡点。@pushiming77 给你一点站内资料，不知道是否已看过：
使用CFSE监测淋巴细胞增殖（视频篇）
CFSE检测淋巴细胞增殖的玄妙之处（4个关键）

niwanmao

两次细胞活力相差很大啊

pushiming77

niwanmao 发表于 2013-6-21 12:31

                               
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两次细胞活力相差很大啊

这一点我也看出来了。取材方面都是一样的。那有哪些方面还会影响细胞活力呢。我再想增殖峰分的不够明显，是不是CFSE的浓度用的太大了。当然CFSE的浓度也会影响细胞的活力的。我现在也做了更低浓度的CFSE，结果要后天才出来。

niwanmao

pushiming77 发表于 2013-6-21 14:30

                               
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这一点我也看出来了。取材方面都是一样的。那有哪些方面还会影响细胞活力呢。我再想增殖峰分的不够明显 ...

CFSE确实挺难做的，其最佳浓度、作用时间都需要摸索。象你下面这个增殖峰明显的图已经算是做的不错了。

pushiming77

niwanmao 发表于 2013-6-21 14:39

                               
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CFSE确实挺难做的，其最佳浓度、作用时间都需要摸索。象你下面这个增殖峰明显的图已经算是做的不错了。 ...

这样呀，那我心理自悲感开始少一点了，谢谢帮助，我一定会把条件建立的更好的。

mybiosciences

是不是浓度太高了，看过一篇文献，1.0*10^7细胞，CFSE用量是1μM，20℃，染色5分钟

mybiosciences

pushiming77 发表于 2013-6-21 16:44

                               
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这样呀，那我心理自悲感开始少一点了，谢谢帮助，我一定会把条件建立的更好的。 ...

是不是浓度太高了，看过一篇文献，1.0*10^7细胞，CFSE用量是1μM，20℃，染色5分钟

pushiming77

niwanmao 发表于 2013-6-24 14:34

                               
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这条件确实很难摸，要在细胞死亡和增殖之间找到一个细胞密度、CFSE浓度两个指标的均衡点。@pushiming77  ...

谢谢，你的回答太有用了。我在试验一下染色时间。

pushiming77

niwanmao 发表于 2013-6-24 14:34

                               
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这条件确实很难摸，要在细胞死亡和增殖之间找到一个细胞密度、CFSE浓度两个指标的均衡点。@pushiming77  ...

很有用呀，谢谢老师