细胞周期分析PI都是单峰

niwanmao

nana_ls 发表于 2016-10-19 12:11
又做了一次，您看看这次又是为什么呢？PI显示染上颜色了，但是用modifit分析峰的位置还是不行。 ...

方法有没有问题？我觉得你可能固定出了问题，细胞全碎了。

nana_ls

niwanmao 发表于 2016-10-19 13:30
方法有没有问题？我觉得你可能固定出了问题，细胞全碎了。

细胞用0.3mlPBS重悬，加0.7ml预冷无水乙醇，4度过夜的，是不是有什么问题。是的，固定以后细胞都碎了

niwanmao

nana_ls 发表于 2016-10-19 17:18
细胞用0.3mlPBS重悬，加0.7ml预冷无水乙醇，4度过夜的，是不是有什么问题。是的，固定以后细胞都碎了 ...

方法错误。细胞离心后，直接往里面加入70％乙醇，不能加无水乙醇，尽管你的终浓度是70％，但是细胞接触的时候是无水乙醇，所以细胞就死光了。

happyeday

倪老师：您好！之前听过一个讲座，说如果直接用70%的乙醇重悬的话，细胞沉淀内部的细胞固定会不好。我也没有自己做过。有些疑惑。

niwanmao

happyeday 发表于 2016-10-20 16:53
倪老师：您好！之前听过一个讲座，说如果直接用70%的乙醇重悬的话，细胞沉淀内部的细胞固定会不好。我也没 ...

滴乙醇有技巧的，一种比较好的方法就是将70％乙醇在振荡器上不停振荡，然后往里面一滴一滴地加细胞悬液。

happyeday

哦。也就是说在充分震荡的条件下，混匀细胞和乙醇。可如果是细胞悬液的话，再加70%的乙醇，那最后的终浓度是？

nana_ls

niwanmao 发表于 2016-10-19 18:09
方法错误。细胞离心后，直接往里面加入70％乙醇，不能加无水乙醇，尽管你的终浓度是70％，但是细胞接触的 ...

好的，重新固定了试了一下，就是又变成了单峰？ 不知道还是哪一步有问题吗

niwanmao

happyeday 发表于 2016-10-21 09:22
哦。也就是说在充分震荡的条件下，混匀细胞和乙醇。可如果是细胞悬液的话，再加70%的乙醇，那最后的终浓度 ...

细胞悬液滴入70％乙醇，容易造成固定不充分，建议采用前者。浓度没有要求，至少1：1是需要的。

niwanmao

nana_ls 发表于 2016-10-21 09:44
好的，重新固定了试了一下，就是又变成了单峰？ 不知道还是哪一步有问题吗
...

依然全是碎片。


我的建议：
1、做好固定工作，固定前和固定后都在显微镜下看看细胞形态，找出究竟是固定前细胞就有问题还是固定出了问题。
2、注意染液是不是有问题，参考站内染色protocol。

happyeday

谢谢倪老师。实验的细节很重要啊！