大开眼界，体内流式细胞术如何检测循环肿瘤细胞？

niwanmao

《Methods Mol. Biol.》是一本生物学方法学方面的书籍，经常会更新各种方法。在最近一期，看到上海的Wei Xunbin等人在上面发了一个章节，是关于体内流式细胞术检测循环肿瘤细胞的，觉得挺有意思，挑选关键性易懂的部分编译给大家。

尽管癌症治疗进展较快，但转移性疾病仍然是导致癌症相关死亡的主要原因。转移是肿瘤细胞扩散到其他组织或器官的多阶段过程。它起始于原发性肿瘤细胞侵袭，随后侵入肿瘤周围的血管。然后肿瘤细胞作为单循环肿瘤细胞（单个CTC）或循环肿瘤细胞簇（CTC簇）循环进入血管，转移到远处毛细血管，CTC透过血管内皮层和基底膜，然后定居以形成转移。然而，大多数CTC在血液中死亡，而少数CTC可以成功转移。

Ashworth在1869年首次报道了CTC。在大多数上皮起源的癌症中都可检测到CTC，包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌以及非上皮性癌症（如多形性成胶质细胞瘤和黑素瘤）。检测CTC是评估复发风险、监测治疗和指导抗癌治疗的有力工具。在肿瘤发展的早期阶段，CTC就可以出现在患者的血液中，但非常稀少，在7.5ml血液中仅为1个CTC，这意味着要从10E10血细胞中检测出1个CTC，需要CTC检测技术具备高灵敏度和高特异性。通常，常规CTC检测方法通常包括两个步骤：富集和检测。富集主要是基于CTC的各种性质，包括大小、密度、细胞表面蛋白表达等。检测方法可以分为三种类型：免疫介导的方法、基于细胞术的方法和基于RT-PCR的方法。

所有这些体外方法都需要抽取大量的血液样品。 然而，CTC是循环中罕见的细胞。 因此，很难知道什么时候抽血比较合适，而使用这些方法可能会错过CTCs。

为了克服常规方法的局限性，Lin等人开发了一种体内检测CTC的技术，称为体内流式细胞术（IVFC），结合了标准流式细胞术和共聚焦检测的概念。 IVFC已被证明可以用来稳定可靠地检测CTC的数量。 第一代IVFC是基于荧光激发的原理，之后其他类型的IVFC设备也被陆续研发出来。

基于荧光的IVFC

在使用这种类型的IVFC检测CTC之前，需要对感兴趣的细胞进行标记。 基于荧光的IVFC的基本原理与传统的FCM相似，只是使用生物体内的天然血管代替常规流式细胞仪中的流动室。 当荧光标记的细胞通过聚焦在血管上的激光束的狭缝时，可以激发它发射荧光。 然后可以通过PMT检测该信号（结构详见下图）。 因此，可以长时间获得生物信息而无需抽血。



图中简称
CL：柱面透镜；MS1～MS2：机械狭缝；AL1～AL3：消色差透镜；DM1、DM2：双向分光镜；F1、F2：带通滤光片；PMT：光电倍增管；M1：镜子；DAQ：数据获取


将5×10E6转染GFP的HCCLM3细胞（肝癌细胞株）打到小鼠背部，形成原位种植肿瘤，然后将肿瘤块切成1×1×1mm，植入小鼠上腹部，接着用体内流式细胞术检测耳朵血管中通过的肝癌细胞的GFP信号（如下图）。


光声流式细胞术

光声流式细胞术（PAFC）是基于光声效应检测CTC的很有前途的方法。 由于感兴趣的细胞和背景之间的光吸收率不同，光声效应的强度差别很大。 因此，可以在体内检测某些特定的癌细胞，例如黑素瘤细胞。扎夫罗夫（Zharov）等人首先发明了PAFC， 已经应用于检测白细胞和其他癌细胞等。

当激光照射生物组织时，组织吸收能量，导致轻微的温度升高，从而引起热弹性膨胀， 然后产生声或应力波，这被称为光声效应。 这是光能转换成热能的过程。 基于这一原理，当细胞具有较高的光吸收率流过穿过血管的脉冲激光束时，与血液背景相比，它们将产生更高强度的超声波。 超声波可以通过压电传感器检测。 通过这个原理，可以实现黑素瘤CTC的体内检测。 B16F10是一种黑色素瘤细胞，含有黑色素，用于光声信号检测。

下图同时显示了荧光体内流式细胞术（IVFC）和光声流式细胞术（PAFC）的原理对比。1指的是IVFC，当荧光标记的细胞通过激光照射点时，就会发生荧光信号，从而被PMT记录。2指的是PAFC，当有较高光吸收率的细胞通过照射血管的脉冲激光束时，通过超声传导器可记录到该细胞产生的高强度超声波。



下图是PAFC检测小鼠体内黑色素瘤细胞。小鼠皮下注射B16F10黑色素瘤细胞株之后，每周检测至少10分钟信号，直至死亡。a图是原始的光声信号，b图是经过一段时间检测后，对10次检测信号进行平均化并经除噪处理后的信号，c图是除噪后的光声信号，d图是对一段时间的信号进行快速傅立叶转换后的结果。



最后我们流式中文网对这项技术进行一下简单总结：体内流式细胞术有实时、无需抽血和处理的优点，可能可以做到床边监测，但目前无论是荧光还是光声体内流式，基本上都是在动物体内做的实验，还无法做到人体，而且无法实现多参数检测，但至少对于一些特定癌症还是挺有意思的。不过目前外泌体等胞外颗粒物的兴起，使得CTC被渐渐淡化，以后究竟谁是英雄呢？你也来聊聊吧！


参考文献：
Wei Xunbin,Zhou Jian,Zhu Xi et al. A Noninvasive and Real-Time Method for Circulating Tumor Cell Detection by In Vivo Flow Cytometry.[J] .Methods Mol. Biol., 2017, 1634: 247-262.
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTMwNjB8ZTU2YzAxZDJ8MTcxNDkwOTI0MXwwfA%3D%3D

a86856635

PAFC这个技术还是很有应用价值的，虽然单一但是准确可信。

ypfbluesky

关键是怎么把肿瘤细胞和正常细胞区分开，肿瘤细胞在光吸收率特别高吗？

niwanmao

ypfbluesky 发表于 2017-8-25 16:55
关键是怎么把肿瘤细胞和正常细胞区分开，肿瘤细胞在光吸收率特别高吗？

...

他们测的是黑色素瘤细胞，这类肿瘤细胞的信号特别强，所以容易区分。

ypfbluesky

niwanmao 发表于 2017-8-25 20:00
他们测的是黑色素瘤细胞，这类肿瘤细胞的信号特别强，所以容易区分。

原来是黑色素瘤细胞，没注意到。不过这样也局限了能检测的肿瘤细胞类型了

niwanmao

ypfbluesky 发表于 2017-8-28 09:22
原来是黑色素瘤细胞，没注意到。不过这样也局限了能检测的肿瘤细胞类型了 ...

总会慢慢完善的吧，一起努力吧