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流式荧光染料分哪几类?

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发表于 2020-3-31 15:49:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞学的发展,最重要的促进力量是抗体,其次就是与仪器检测能力配套的荧光染料。荧光染料目前仍跟不上仪器检测通道数量的发展。

现有的流式荧光染料可分为以下11大类:
1、有机小分子
提起有机小分子,大多数人肯定一头雾水,但是如果我举出几个例子,肯定恍然大悟。
FITC(分子量389 Da)、Alexa Fluor 488(FITC类似物,分子量643 Da)、Texas Red(TxRed,分子量625 Da)、Alexa Fluor 647(分子量1155 Da) 、Pacific Blue(分子量242 Da)和Cy5(分子量762 Da)。是不是基本上都用到过?
这些有机小分子具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移(激发波长和发射波长之间的差,大约为50-100 nm),光稳定好,容易与抗体偶联,所以应用广泛。
值得一提的是Alexa Fluor染料光稳定性较FITC更好,所以如果要做成像的话,可选择它们。

2、藻胆蛋白
藻胆蛋白(Phycobiliproteins)是从蓝藻、鞭毛藻等藻类中提取的大蛋白分子,例如藻红蛋白(PE)的分子量为240,000 Da。 这些蛋白质具有较大的斯托克斯位移(75-200 nm),并且具有稳定的发射光谱。 由于藻胆蛋白较大,因此它们在结合过程中通常具有1:1的蛋白质与荧光染料比率,因此对于定量流式细胞术非常有用。
但是,藻胆蛋白易受光致漂白,因此不建议长时间或反复暴露于激发光源中。
藻胆蛋白家族中,除了藻红蛋白(PE)外,还有别藻蓝蛋白(APC)和苦瓜素叶绿素蛋白(PerCP)。

3、量子点
量子点(Qdots)是半导体纳米晶体,具有与纳米晶体尺寸密切相关的荧光发射光谱。 它们最适合被紫外或紫光激发,但也容易被其它激光少量激发,因此,在多参数实验中使用Qdots时,其它波长激光器的这种微小激发,却会使荧光补偿变得复杂。
正是如此,虽然量子点染料亮度高,但由于这些补偿问题难以解决,并且将Qdot结合到抗体上较为困难,所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。

4、高分子染料
高分子(聚合物)染料由收集光信号的聚合物链组成,可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基,“调节”吸收和发射特定波长的光。 这些染料非常稳定,并且与藻胆蛋白具有相似的量子效率,光稳定性大大提高。
由于可以使聚合物染料仅吸收特定波长的光,因此避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。
高分子染料中典型的代表是Brilliant Violet (BV)、Brilliant Ultraviolet (BUV) 和Brilliant Blue (BB)。

5、串联染料
串联染料将藻胆蛋白(PE,APC,PerCP)或高分子染料(BV421,BUV395)与有机小分子荧光染料(Cy3,Cy5,Cy7)化学偶联,利用荧光能量转移(FRET),形成单激光激发更多波长的发射光。
例如,Texas Red的最大激发为589 nm,而PE的发射为585 nm,因此通过将PE与Texas Red耦合,PE的发射光通过FRET激发Texas Red,从而使PE-TxRed可用488 nm或532 nm的激光器激发。
高分子抗体也可使用相同的方法串联有机小分子染料。
串联染料非常亮,具有较大的斯托克斯位移值(150-300 nm),这在检测低密度的抗原时非常有用。但是,串联染料的稳定性不如供体荧光染料,并且能量转移效率因批次而异,使补偿复杂化。

6、重金属离子
重金属离子严格说起来不算荧光素,但是我们也在此一起提一下。
用于质谱流式的抗体,不是用荧光素结合的,而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。 目前商业上有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。 这些探针是非荧光性的,仅适用于质谱流式分析。

7、荧光蛋白
荧光蛋白经常用作基因表达的报告系统。最常用的是来自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)。 由此衍生出CFP和YFP。
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红色荧光蛋白(DsRed)来自蘑菇海葵Discosoma,从DsRed衍生出下一代单体荧光蛋白(mCherry,mBanana),并具有更宽的激发和发射光谱。
随着基因克隆技术的成熟,目前荧光蛋白已有数百种,其激发和发射光谱范围从紫外线到近红外。

8、核酸染料
核酸染料结合DNA、RNA或两者均结合。 它们可用于定量DNA进行细胞周期分析(如PI,7-AAD,DyeCycle Violet,DAPI),分选染色体(如Hoescht 33342, Chromomycin A3),利用侧群分析对干细胞进行分选(如Hoescht 33342),死活细胞区分以及对细菌进行分选。
将核酸染料与另一种标记物(例如荧光染料偶联的抗溴脱氧尿苷(BrdU))结合使用,能确定增殖水平。
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9、细胞增殖染料
用BrdU(溴脱氧尿嘧啶核苷)孵育细胞,使其掺入细胞DNA合成过程,然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色,便可测量细胞增殖。 但是,此方法不适合长期增殖研究。
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。CFSE染料的红色和紫色变种现在也已经有了。这些染料在合适的浓度下,不影响细胞生长或形态,适合长期增殖研究。
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10、细胞死活染料
细胞活力可以通过排除性染料(如碘化丙啶、DAPI)确定,也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测。
排除性染料不能固定,仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。
胺类染料包括Live/Dead(ThermoFisher),Zombie(Biolegend)或Fixable Viablity(BD Biosciences),适用于固定的细胞,因此适合那些有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。
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11、钙指示剂染料
钙指示剂染料与钙结合后会发生色移,可用于指示细胞激活和信号传导。
最常用的染料仍然是indo-1,即紫外双相钙探针。 另外还有fluo-3的Blue-green calcium probes。
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文献来源:Current Protocols in Immunology,Chapter 5.1.4, Flow Cytometry: An Overview
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