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在任何实验之前，验证和优化所使用的试剂是很好的做法。 在流式细胞术中，这些试剂通常是指特异性抗体。 使用过多或过少的抗体都会导致非特异性染色增加，信噪比降低，灵敏度降低，表达水平与染色强度之间缺乏线性关系，增加了实验成本。 因此，为实验确定最佳抗体浓度是非常重要的，这一点怎么强调都不为过。 抗体的最佳浓度或“滴度”必须根据检测目标、染色条件(即染色时间和温度)以及批次而定。 活细胞可能与固定细胞有不同的最佳染色条件，细胞表面染色的蛋白质与细胞内染色的相同蛋白质不同。 由于商业试剂不太可能在您所用的特定实验条件下进行测试，因此也应该始终进行滴定，而不是按照制造商推荐的滴度或浓度使用。
为确定染色抗体的最佳效价，建议对抗体进行连续稀释。 如果不知道从哪个浓度开始，通用起点是10μg/mL抗体，然后按1：2顺序稀释6至8个梯度。 在实际实验中，用于滴定的细胞数应与染色的细胞数相对应。 然而，虽然细胞数量影响染色质量，但在相当大的密度范围内，例如10E5-5×10E6个细胞，染色往往相当稳定的。 一旦滴定，抗体浓度通常在细胞浓度的10到50倍范围内提供相似的染色质量。 如果细胞浓度增加超过这一点，通常将抗体浓度增加两到三倍就足够了，或者快速进行两到三步滴定就足够了。
一旦制定了滴定梯度，有几种方法可以评估数据以确定最佳滴定。 最简单的方法是计算阳性群体(如CD4单抗染色)的MFI与阴性群体的MFI的比率，即SNR(见下图，另外考虑到阴性群体的CV，还有一个染色指数的指标，可能更好，见：https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4540-1-1.html)。 最佳分离就是信噪比最高的，像下图这样，0.68μg/mL或1：800稀释是最佳浓度。
需要考虑的其他方面包括：
1. 在使用抗体时，抗体的浓度是最关键的参数，即当实验放大到更大的体积染色时，需要相应地增加抗体的量，以保持浓度不变。
2. 在滴定抗体时，确保阴性细胞群不表达感兴趣的抗原，这有助于正确评估背景染色。 如果群体中没有“阴性”细胞，可以考虑在细胞中掺入阴性细胞。
3. 一旦确定了最佳滴度，在发表结果时，请注明最佳染色的染色抗体浓度，而不是稀释倍数。
4. 如果可能，使用多个标记共染的方法，识别与要滴定的标记共表达或非共表达的细胞亚群。这将有助于确认滴定抗体的特异性。
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发表于 2020-11-5 15:35:22
发表于 2020-11-11 15:22:45
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