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[磁珠分选] 磁珠分选细胞活率低,这是为什么?

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 楼主| 发表于 2021-2-18 09:39:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
骨髓血稀释后,用Ficoll分离PBMCs细胞,再用CD34磁珠分选,结果得到的细胞活率只有40%,请问大家知道这是什么原因造成的吗?
下面是一些操作的具体参数
1. 2mL骨髓血用1mLbuffer(BSA Stcok Solution:autoMACS Rinising Solution=1:20)稀释;
2. 用100 μm filter过滤血样,3mLFicoll差速离心分选(400g35min20℃升9降0),取白膜层;
3. buffer洗涤细胞两遍;
4. 最后0.6mL buffer重悬细胞,100 μl FcR Blocking Reagent+100 μl CD34 MicroBeads UltraPure的磁珠4°C孵育30min;
5. 10 mL buffer洗涤细胞一次,1mLbuffer重悬细胞,过柱;
6. 最后分选得到的BM-MNCS:活率95%左右,细胞11M左右;BM-CD34:活率40%左右,细胞0.1M左右;
之前我用同样的方法分选过几次7、8mL的骨髓血没有出现过这种状况,分离出的BM-CD34活率大于95%,大体步骤是一样的,只是用的6mL buffer 稀释血样,Ficoll用的15mL,磁珠抗体用量翻一倍;

发表于 2021-2-18 12:33:24 | 显示全部楼层
台盼蓝染色区分死活?还是用死活染料在流式上区分?
一般建议后者。

另外,也请@Lydia  @yxyyjs  两位有经验的站友帮忙指导一下这个问题。
发表于 2021-2-18 14:37:51 | 显示全部楼层
     我自己做脾脏细胞、淋巴结细胞、外周血细胞磁珠分选比较多,而且失败的经历比较多
     绝大多数时候是纯度在50-80%左右,感觉把0.5%-5%比例的细胞富集到50-80%左右在磁珠分选上比较容易,90%+以上的纯度能做到真的好难,而且耗柱子,多次过柱子伤不起啊,现在美天旎买磁珠套装好像已经不送柱子了
     细胞活力的话,我不大喜欢台盼蓝,一般简单点分选前后染mark时顺便再染个PI或者死活染料,流式上机时同时看一下。还有在动物取材、制备细胞悬液等过程中冰浴真的很重要,确实可以使活力高一些。
     很多时候,一两个人,从取材到拿到细胞,再分选(孵育抗体和磁珠,离心漂洗,润柱,洗柱,收样,真的是手忙脚乱),再流式验证,一通操作下来要五六个小时都不止,所以经常预实验还可以,但正式实验十来只老鼠取材,最后的结果往往比较挫……所以人多很重要,12只老鼠,从取材这一步开始,五六个人分工协作,每一步都算准时间,补位意识再强一些,很有可能分选的结果会有惊喜。

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 楼主| 发表于 2021-2-20 08:54:37 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-18 12:33
台盼蓝染色区分死活?还是用死活染料在流式上区分?
一般建议后者。

我是用AOPI染色区分死活的
 楼主| 发表于 2021-2-20 08:56:32 | 显示全部楼层
yxyyjs 发表于 2021-2-18 14:37
我自己做脾脏细胞、淋巴结细胞、外周血细胞磁珠分选比较多,而且失败的经历比较多,
     绝大多数 ...

感谢~下次尝试一下在冰浴
 楼主| 发表于 2021-2-20 09:01:11 | 显示全部楼层
给大家分享几个说明书

Ficoll protocol_16156_10061.PDF

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DS_CD235a (Glycophorin A) MicroBeads_human_130-050-501.pdf

233.04 KB, 阅读权限: 20, 下载次数: 1

DS_CD34 MicroBead Kit_human_130-046-702.pdf

293.5 KB, 阅读权限: 20, 下载次数: 1

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发表于 5 天前 | 显示全部楼层
建议如果条件允许或者需要大量分选不同细胞的话,可以考虑用间接法 吸附磁珠用磁力架去吸附 然后全程冰上操作 最后出来计数完成之后取一点染死活染料上流式看一下

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