磁珠分选细胞活率低，这是为什么？

yluo

骨髓血稀释后，用Ficoll分离PBMCs细胞，再用CD34磁珠分选，结果得到的细胞活率只有40%，请问大家知道这是什么原因造成的吗？
下面是一些操作的具体参数
1. 2mL骨髓血用1mLbuffer（BSA Stcok Solution：autoMACS Rinising Solution=1：20）稀释；
2. 用100 μm filter过滤血样，3mLFicoll差速离心分选（400g，35min，20℃；升9降0），取白膜层；
3. buffer洗涤细胞两遍；
4. 最后0.6mL buffer重悬细胞，100 μl FcR Blocking Reagent+100 μl CD34 MicroBeads UltraPure的磁珠4°C孵育30min；
5. 10 mL buffer洗涤细胞一次，1mLbuffer重悬细胞，过柱；
6. 最后分选得到的BM-MNCS：活率95%左右，细胞11M左右；BM-CD34：活率40%左右，细胞0.1M左右；
之前我用同样的方法分选过几次7、8mL的骨髓血没有出现过这种状况，分离出的BM-CD34活率大于95%，大体步骤是一样的，只是用的6mL buffer 稀释血样，Ficoll用的15mL，磁珠抗体用量翻一倍；

niwanmao

台盼蓝染色区分死活？还是用死活染料在流式上区分？
一般建议后者。

另外，也请@Lydia  @yxyyjs  两位有经验的站友帮忙指导一下这个问题。

yxyyjs

     我自己做脾脏细胞、淋巴结细胞、外周血细胞磁珠分选比较多，而且失败的经历比较多，
     绝大多数时候是纯度在50-80%左右，感觉把0.5%-5%比例的细胞富集到50-80%左右在磁珠分选上比较容易，90%+以上的纯度能做到真的好难，而且耗柱子，多次过柱子伤不起啊，现在美天旎买磁珠套装好像已经不送柱子了
     细胞活力的话，我不大喜欢台盼蓝，一般简单点分选前后染mark时顺便再染个PI或者死活染料，流式上机时同时看一下。还有在动物取材、制备细胞悬液等过程中冰浴真的很重要，确实可以使活力高一些。
     很多时候，一两个人，从取材到拿到细胞，再分选（孵育抗体和磁珠，离心漂洗，润柱，洗柱，收样，真的是手忙脚乱），再流式验证，一通操作下来要五六个小时都不止，所以经常预实验还可以，但正式实验十来只老鼠取材，最后的结果往往比较挫……所以人多很重要，12只老鼠，从取材这一步开始，五六个人分工协作，每一步都算准时间，补位意识再强一些，很有可能分选的结果会有惊喜。

yluo

niwanmao 发表于 2021-2-18 12:33
台盼蓝染色区分死活？还是用死活染料在流式上区分？
一般建议后者。

我是用AOPI染色区分死活的

yluo

yxyyjs 发表于 2021-2-18 14:37
我自己做脾脏细胞、淋巴结细胞、外周血细胞磁珠分选比较多，而且失败的经历比较多，
     绝大多数 ...

感谢~下次尝试一下在冰浴

yluo

给大家分享几个说明书

大品咿呀哟

建议如果条件允许或者需要大量分选不同细胞的话，可以考虑用间接法 吸附磁珠用磁力架去吸附 然后全程冰上操作 最后出来计数完成之后取一点染死活染料上流式看一下