关于用PI测定细胞周期的问题

steven

大家好，因为最近流式做的少，好久没来发帖子了。

这几天在做PI测定细胞周期的实验，具体来说就是先用FACS把目标细胞分出来，然后一部分用PI测细胞周期，另一部分养起来，看处理之后细胞周期如何变化。
现在的问题是，FACS分选之后立即测细胞周期的这一部分结果有点奇怪，总是多出一个峰，做了两次都是一样的结果。
第一次500，1000，2000的位置各有一个峰。
第二次1000，2000，4000的位置各有一个峰。
各个峰之间都是2倍关系，这怎么判断啊。
第一次感觉1000的位置是2N，2000是4N，500的是凋亡细胞，但是恰好是2倍关系也让我有点迷惑。
所以又重新做了一次，结果还是一模一样（包括第二峰和第三峰之间都出现了一个小峰）。
选择单细胞时是用的FSC-A/H的这种策略，可能是单细胞选的不准吗？

还有一个问题，细胞量少的时候，处理样本的时候有什么注意的小技巧吗？以第二次实验为例，FACS分选出来15万的细胞，然后固定之后离心还可以看见白色的沉淀，但洗细胞之后离心就看不见白色沉淀了，最终上样只检测到3000的细胞。。。都损失掉了，但是只是PBS冲洗了一次，没有什么过多的操作啊。怎么能保证尽量把细胞留下来啊。之前细胞量充足的情况下，从来没考虑过这个问题，最近要对分选之后的细胞进行再次染色等实验，在细胞量20万左右的情况下，因为细胞流失造成最后没有结果好几回了，最惨的一次上样时只有几百个细胞了（经过了固定，一抗孵育，二抗孵育等操作）。

希望大家有好办法可以分享一下。

niwanmao

凋亡峰大多数不是这样的。
你用的是什么细胞？有没有经过什么处理？

至于样本处理，你用的离心速度是怎么样的？

steven

niwanmao 发表于 2021-6-26 09:14
凋亡峰大多数不是这样的。
你用的是什么细胞？有没有经过什么处理？

是将原代肝脏细胞进行培养，通过添加小分子化合物选择性增殖其中的肝脏祖细胞。然后用Trypsin/EDTA消化下来之后FACS分选（通过大小，不进行染色），分选之后直接离心，MeOH固定，PI染色。恰好三个峰都是2倍关系，不知道如何分析了。
样本处理的话，400xg，2min离心。是不是速度太低了，还可以提高离心速率吗？

谢谢倪老师。

niwanmao

steven 发表于 2021-6-28 13:22
是将原代肝脏细胞进行培养，通过添加小分子化合物选择性增殖其中的肝脏祖细胞。然后用Trypsin/EDTA消化下 ...

能否在样本中，掺入正常人外周血，重复一次。

steven

niwanmao 发表于 2021-6-28 16:09
能否在样本中，掺入正常人外周血，重复一次。

忘记说明了，用的是大鼠的肝脏细胞。
另外掺入外周血是什么目的呢？目前的情况有哪些可能的原因呢？

tiger

steven 发表于 2021-6-29 10:00
忘记说明了，用的是大鼠的肝脏细胞。
另外掺入外周血是什么目的呢？目前的情况有哪些可能的原因呢？ ...

掺入大鼠的PBMC做为内参，培养的肝细胞很可能是多倍体

niwanmao

steven 发表于 2021-6-29 10:00
忘记说明了，用的是大鼠的肝脏细胞。
另外掺入外周血是什么目的呢？目前的情况有哪些可能的原因呢？ ...

掺入外周血淋巴细胞，是为了获得倍体参照。
如果做的是大鼠的肝脏细胞，可考虑用对应的正常倍体细胞做参照，从而了解最终做出来的实验结果真实倍体。

steven

tiger 发表于 2021-6-29 10:58
掺入大鼠的PBMC做为内参，培养的肝细胞很可能是多倍体

谢谢指导，原来是这样。确实分选的细胞中可能会掺入肝细胞。
感谢
PS. 刚才又查了一下资料，分选的细胞（祖细胞）本身就可能是多倍体，所以可能不是掺进去的肝细胞影响，确实需要一个合适的内参。

steven

niwanmao 发表于 2021-6-29 13:01
掺入外周血淋巴细胞，是为了获得倍体参照。
如果做的是大鼠的肝脏细胞，可考虑用对应的正常倍体细胞做参 ...

谢谢倪老师。
刚才又查了资料，确实培养的祖细胞可能是多倍体，我选择个合适的细胞做内参。
另外，如果对照实验不能同一天进行（比如我需要测1）分选后，2）分选后继续培养的细胞），可不可以记录所应用的机器参数，然后第二次也按照相同的参数在不同的时间进行检测啊。
有人说可以将细胞固定之后（比如EtOH）在-20度保存到下次一起检测，这种方式可取吗？

niwanmao

steven 发表于 2021-6-30 13:56
谢谢倪老师。
刚才又查了资料，确实培养的祖细胞可能是多倍体，我选择个合适的细胞做内参。
另外，如果对 ...

乙醇固定后，-20度保存，定期批量检测即可。