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用简单的流式细胞术对 SARS-CoV-2 的 T 细胞记忆功能进行评估

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 楼主| 发表于 2021-10-5 11:26:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一般来说,评估对SARS-CoV-2免疫力的首选方法是检测患者血清中的病毒特异性抗体。然而,有些患者由于原发性免疫缺陷还是继发于免疫抑制药物治疗,无法产生病毒特异性抗体或水平非常低,此时的抗体评估就不行了。这时,就需要评估抗病毒的T细胞反应,替代血清学检测。但大多数 T 细胞检测是非常费力的,不适合临床常规实验室。
萨拉·林德·伊诺克森等人将Flow-cytometric Assay for Specific Cell-mediated Immune response in Activated whole blood (简称FASCIA,是Marits等人2014年针对感染性病原体开发的检测方法),用于检测针对 SARS-CoV-2 的活化T细胞母细胞样转化(此处命名为blasts)的数量,根据这些特异性转化的细胞数量,进而确定体内是否存在对SARS-Cov-2的特异性记忆T细胞。
该测定在既往感染 SARS-CoV-2 的个体和健康血清阴性献血者身上得到验证,对既往感染 SARS-CoV-2 的敏感性为 74%,特异性为 96%。该检测的效果在一名有 COVID-19 病史的常见可变免疫缺陷(CVID)患者中得到证明。 T 细胞功能检测是对 SARS-CoV-2 细胞免疫评估中血清学的临床相关补充,任何具有流式细胞术能力的常规实验室都可以开展。
为了验证该测定,作者采集了COVID-19 恢复期血浆 (CCP) 捐献者和血清阴性、无COVID-19 病史的健康献血者的肝素化血液样本。商陆有丝分裂原(PWM)用于确认一般 T 细胞反应性,在所有测试对象中均观察到正常的活化细胞形成。HC 和 CCP 两组之间在年龄或 T 细胞计数方面没有观察到显著差异。
FASCIA分析策略如下: (A) 未受刺激(左)和 PWM 刺激(右)中blasts(高 FSC)的设门策略(看到这个图,我不禁要插一句,之前在论坛上,不少站友问道,为什么细胞刺激后,淋巴细胞分两群,其实这里的图就给了大家一个答案,那就是T细胞活化后,发生了母细胞样转化)。 CD4+blasts定义为CD3+CD4+,CD8+blasts定义为CD3+CD4-。 (B) HC (n=41) 和 CCP 供者 (n=56) 的T细胞对刺突多肽的反应。 (C) HC (n=46) 和 CCP 供者 (n=46) 的T细胞对全病毒颗粒的反应。(D) 用完整病毒颗粒刺激的 CCP 供体中 CD4+ 和 CD8+ blasts之间的相关性 (n=46)。 (E) HC 和 CCP 供者中用完整病毒颗粒刺激后 CD4+ 和 CD8+ blasts的 ROC 曲线(n=46)。 (F-G) 随着时间的推移,CCP 供者中的 CD4+ blasts比例变化。样品间隔 3-4 周 (F) 和 4-5 个月 (G) 采集。
20211005_093502.jpg
从上面的图形结果可见:
1. 商品化的SARS-CoV-2 抗原刺激物,包括肽库和来自核衣壳 (N) 和刺突 (S) 蛋白的全蛋白,在大多数情况下,诱导的blasts反应非常低,并且CCP供者的反应与健康对照的反应没有显著差异(图 1b)。低反应可能是由于抗原呈递效率低下和/或肽库中缺乏先天辅助信号。从理论上讲,这些问题可以通过增加抗原浓度来克服,但高浓度多肽可增加非特异性背景荧光,故不具有可行性。
2. 含有 SARS-Cov2 全病毒颗粒的上清液,与来自刺突蛋白的肽库相比,可诱导CCP供者T细胞更明显的反应,并且在血清阴性对照组中显示出更少的交叉反应性。在 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中均观察到两组之间的显著差异,以CD4+ T 细胞群中最为明显(图 1c)。 CD8+ T 细胞反应的幅度明显偏低,这可能是由于抗原主要通过MHC II 类分子呈递以及 FASCIA 中交叉呈递效果不佳。然而,CD4 和 CD8 反应之间的相关性(图 1d)表明 FASCIA 中的 CD4+ T 细胞反应是针对 SARS-CoV-2 的总 T 细胞反应性的有效替代标记。
3. FASCIA 对整个病毒颗粒的灵敏度为 74%,对既往感染 SARS-CoV-2 的特异性为 96%,使用的cut-off值为 50 个CD4+ T 细胞blasts/μl(图 1e)。 CD4+ T 细胞反应的 ROC 曲线下面积为 0.91。

至于FASCIA 中的 CD4+ T 细胞反应与抗体滴度,从下图可见,两者之间没有明显的相关性:
20211005_111210.jpg
上图里面值得注意的是,一部分 CCP 供体显示出大量的 CD4+ T 细胞blasts (>500) 和中等抗体水平,而另一组具有较低的 CD4+ T 细胞反应但抗体滴度较高,这与其他研究结果是一致的(Sekine, et al.2020;Rydyznski Moderbacher, et al.2020;Schwarzkopf, et al.2021),反映了免疫反应生物学的潜在差异,仍有待研究。然而,这意味着 FASCIA 具有与抗体反应无关的诊断价值,对于抗体反应评估疫苗反应有着很强的补充作用。

最后,作者特地提到了一个案例,证明了抗原特异性记忆T细胞评估疫苗反应的重要性,该患者是一名 42 岁男性,患有常见变异免疫缺陷 (CVID),符合 CVID 的所有诊断标准,包括低 IgG(在 IgG 替代治疗前约为 2g/L)、缺乏 IgM 和 IgA 以及对疫苗接种的反应较弱。患者自 20 年前发病以来一直在接受免疫球蛋白替代治疗。患者平时经常发生细菌性呼吸道感染,最近出现肉芽肿性淋巴细胞间质性肺病 (GLILD),故以高剂量皮质类固醇和依鲁替尼治疗。在开始依鲁替尼治疗后大约 3 个月,患者感染了 COVID-19,经PCR证实。症状轻微,包括喉咙痛、背痛、疲劳和低烧。该患者无需就医,而是住处门诊诊所外的 COVID-19 检测中心进行检测。患者定期在原发免疫缺陷病诊所就诊。在他的一次定期访问中,感染后 3 周,抽取了血液用于分析 COVID-19 抗体和 FASCIA实验。患者在 FASCIA 分析中能看到明显的阳性反应(131 个CD4+ blasts/μl),而他的 COVID-19 IgG 抗体呈阴性。 5 个月后的 COVID-19 血清学随访样本显示,针对刺突蛋白的 IgG 阳性反应仍较低。这种现象说明,患者在 covid-19感染后自身产生抗体能力非常低,依鲁替尼治疗进一步降低了这种能力。尽管无法产生任何内源性抗体,但他完全能够从 COVID-19 感染中恢复,这证实了FASCIA检测的抗原特异性记忆T细胞功能检测的重要性。

通篇看下来,抗原特异性T细胞的功能反应,能够对抗体检测起到非常好的补充,尤其是在一些无法产生内源性抗体的免疫缺陷患者中能替代抗体检测,该检测的诊断性能也很高,但可惜的是,方法学上需使用全病毒颗粒,所以可能只能在一些P3实验室才能开展。

文献:
Marits P., et al. Evaluation of T and B lymphocyte function in clinical practice using a flow cytometry based proliferation assay. Clin. Immunol. 2014;153:332–342.
Enoksson SL, et al. A flow cytometry-based proliferation assay for clinical evaluation of T-cell memory against SARS-CoV-2. J Immunol Methods. 2021 Sep 28:113159. doi: 10.1016/j.jim.2021.113159. Epub ahead of print. PMID: 34597619; PMCID: PMC8484816.
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