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标题: 流式细胞术补偿调节9条准则 [打印本页]

作者: niwanmao 时间: 2014-6-5 21:40
标题: 流式细胞术补偿调节9条准则
流式细胞术补偿调节9条准则：
1、用于调节补偿的标本必须单染。
2、样本必须可染出一群阳性和一群阴性，以比较它们之间的平均荧光强度。
3、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检测时）。
4、使用表达强度高的抗体来调节补偿。
5、用来调节补偿的抗体必须与实验用的抗体荧光素一样（例如不能用FITC调节GFP的补偿）。
6、串联染料的抗体如果批号不同，需要再次做补偿。
7、阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。
8、补偿微球可以代替细胞（不过允许做微调）。
9、千万不要做不设置补偿的实验。

（译自美天旎MACS-Academy-Compensation-of-spectral-overlap-in-flow-cytometry）

作者: vtea 时间: 2014-6-5 22:03
3和4会不会鱼与熊掌不可兼得？经常碰到目的分子表达不高，甚至不确定是否会表达，这个时候就只能用其他抗体代替，这样的补偿对结果分析误差大吗？

作者: INTORNS 时间: 2014-6-5 22:28
倪老师：
      对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
   我们买的beckman coulter的仪器，他们技术人员讲每次补偿的时候都必须使用同批次的样本细胞，而且使用实际样本上的抗体及荧光素。所以即使同一荧光素，换用抗体的话，因为结合效率等因素的影响，补偿结果可靠吗？包括使用荧光微球替换细胞，这个目前我们真不敢用。因为我在想，如果第3条和第9条成立的话，通道电压一定的情况下，对于任何细胞样品，通道之间的补偿值不就是一个定值了吗？而这个我问过他们的技术人员，他们讲即使电压一定，补偿值也不是定值，每次都需要调节。
      另外，对造血干细胞（lineage-Sca+Kit+）的检测，其中的lineage是一个系列混合抗体，所以我们在做补偿的时候阴阳性分群不明显，只能大概不准确调节了。如果如您所说，可以替换抗体，倒是可以避开这一问题。
      谢谢！

作者: 苏格兰白草莓 时间: 2014-6-6 00:24
本帖最后由苏格兰白草莓于 2014-6-6 00:33 编辑

INTORNS 发表于 2014-6-5 22:28
倪老师：
对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
我们买的beckman coulter的仪 ...

我觉得应该这样理解，我们调节荧光补偿的目的是因为不同的染料被激发光激发后所发射的波长是不一样的，正因为发射波长的宽度不一样，才会产生通道之间会有不同的干扰信号出现，为了排除这些杂信号，也可以说说所谓的假阳性，我们就需要人为的调节荧光补偿，将杂信号排除，以得到更纯粹一些的信号。所以即便是电压一定的，但是因为荧光物质不同，补偿就会不同，这是荧光物质本身特性来决定的。这就是为什么在同一电压下，你做FITC和做GFP的补偿会是不一样的。换用抗体的话，只是结合效率不相同，但是不同抗体标记相同荧光物质（严格来说甚至是生产公司及批号也要一致）发射波长的宽度范围是不变的，所以换用抗体从理论上讲是可靠的，只是荧光强度不一样，会更亮或者更暗一些。
不过现在随着时代的进步，已经开发出了很多优质的荧光染料，不仅激发效率高，发射波长的范围也很窄，大大提高了流式检测的灵敏度及同时进行更多颜色标记的检测。
在今年的流式年会上重点就提到了这些新型染料，在论坛中应该有提及到的帖子，你可以关注一下。

作者: INTORNS 时间: 2014-6-6 09:35

苏格兰白草莓发表于 2014-6-6 00:24
我觉得应该这样理解，我们调节荧光补偿的目的是因为不同的染料被激发光激发后所发射的波长是不一样的，正 ...

   我理解您的意思。
   但是电压等条件一定的条件下，相同的荧光素偶联相同的抗体，只是细胞样本不一样（这里的不一样指相同细胞不同批次以及不同种类细胞两种情况），那补偿需要重新调节吗？公司的技术人员说需要重新调节，按照您的意思就是不用了。
   就新型染料来说，目前我们还是倾向于使用经典的常用的染料，这样不仅方便参考文献，而且还适合仪器。
   谢谢！

作者: 苏格兰白草莓 时间: 2014-6-6 10:48

INTORNS 发表于 2014-6-6 09:35
我理解您的意思。
但是电压等条件一定的条件下，相同的荧光素偶联相同的抗体，只是细胞样 ...

严格意义上来说，每做一个批次都应该调补偿，但是考虑到成本问题，我们一般是
同样细胞不同批次的，会每周做一次补偿，如果是平时做质控发现激光衰减之类的，我们也会重做补偿，你要是每个批次相隔时间比较久也建议每次做补偿，毕竟我说的是在理论情况下，现实之中仪器的激光会有衰减，或者遇到一些其他的情况，所以还是建议同种细胞，隔一段时间做一下补偿
对于不同种类的细胞，我们还是都要求要做补偿的，因为每种细胞可能出现的自发光，或者是药物处理之后，有些药物会自发光留在胞内，这些情况都建议最好是要做补偿

作者: INTORNS 时间: 2014-6-6 15:36

苏格兰白草莓发表于 2014-6-6 10:48
严格意义上来说，每做一个批次都应该调补偿，但是考虑到成本问题，我们一般是
同样细胞不同批次的，会每 ...

好的，我们会参考您所说的方法。谢谢您的回答。

作者: niwanmao 时间: 2014-6-6 19:44

vtea 发表于 2014-6-5 22:03
3和4会不会鱼与熊掌不可兼得？经常碰到目的分子表达不高，甚至不确定是否会表达，这个时候就只能用其他抗体 ...

3、4本来就是一致的啊，就是应该尽可能用强度高的来调节补偿。

作者: niwanmao 时间: 2014-6-6 19:48

INTORNS 发表于 2014-6-5 22:28
倪老师：
对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
我们买的beckman coulter的仪 ...

同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对真实标本有较好的参考，当然，真实细胞可能还会有点些许差别。compbeads在某个荧光标记抗体找不到强表达的时候特别有用。

如果你做某一项实验的话，强烈建议保持稳定的电压和补偿，尽量不动，至少我们在做临床上免疫分型时都是遵循此项原则。

对于lin系列的混合抗体，是可以通过替换抗体来调节补偿，我认为问题不大。

作者: INTORNS 时间: 2014-6-8 14:50

niwanmao 发表于 2014-6-6 19:48
同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对 ...

好的，我明白了。谢谢倪老师的回答！

作者: peansant 时间: 2014-8-7 11:08
origin of these rules (english edition)

作者: peansant 时间: 2014-8-8 11:09
本帖最后由 peansant 于 2014-8-8 11:21 编辑

“Rule 2”中，调补偿的对照样本必须含有阴性细胞群和阳性细胞群，以便比对median。
“Rule 9"中，补偿微球可以替代细胞。
版主另一个帖子”[图片]从一幅图看补偿是否调整到位“ http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html。

那么，若我有一类细胞，需要8种表面标记物加以鉴定，其中4种是阳性表达，4种是阴性表达（见附件1），问：
1.我培养出该细胞之后，应该如何调节补偿？4种阴性表达抗体的单染管中，荧光应该很难检测，阳性细胞群细胞数目估计很少，是否会影响补偿；
2. 若用补偿微珠替代4种阴性表达抗体的单染管，是否效果更佳？
3.该类细胞比较难培养，想尽量用补偿微球替代，选择补偿微珠时是否有讲究？之前用补偿微珠（见附件2）替代，那边操作仪器的老师说跟我细胞差异太大，不能调补偿，没搞懂啥意思。
4.若没有单染管的信息，只有8种抗体加在一管里的那个DATA和未加抗体的那管的DATA，可以分析补偿调节是否到位吗？结果见附件4。

附件1：抗体信息

mMSC Antibody panal:

CD44+ CD90.2+ CD105+ Sca-1+

CD31- CD34- CD45- CD11b-

品牌	货号	名称	规格	检测通道
Miltenyilbiotec		CD105-PE		FL2
Miltenyilbiotec		CD45-APC		FL6
BD Pharmingen	560452	Ms CD44 V450 0.025 mg IM7	25 ug	FL9
BD Pharmingen	562058	MS LY-6A/E FITC MAB 0.025MG D7	25 ug	FL1
Biolegend	102417	PE/Cy7 anti-mouse CD31 Antibody	25 ug	FL5
Biolegend	128607	PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD34 Antibody	25 ug	FL4
BD Pharmingen	562317	MS CD11B PE-CF594 MAB 0.025MG M1/70	25 ug	FL3
Biolegend	105327	APC/Cy7 anti-mouse CD90.2 Antibody	25 ug	FL8

流式仪器：Gallios 10色（附件3）

作者: niwanmao 时间: 2014-8-8 22:07

peansant 发表于 2014-8-8 11:09
“Rule 2”中，调补偿的对照样本必须含有阴性细胞群和阳性细胞群，以便比对median。
“Rule 9"中，补偿微球 ...

补偿微球我没用过，但从站内站友的讨论（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2560-1-1.html）看的出，应该基本上可以用补偿微球来调节补偿，其补偿值近似淋巴细胞，但如果较大的细胞，或许会有轻微变动。

作者: flyer625 时间: 2014-8-12 16:56
想问一下，单染管作补偿时，除了所加抗体的通道，其他通道要调到一点荧光信号都没有吗？按理说单个通道多少都会有少量光投到其他通道去，怎么样避免过补偿的情况呢？

作者: niwanmao 时间: 2014-8-12 20:57

flyer625 发表于 2014-8-12 16:56
想问一下，单染管作补偿时，除了所加抗体的通道，其他通道要调到一点荧光信号都没有吗？按理说单个通道多少 ...

补偿是否到位，关键看median ： http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html

作者: cdm874386070 时间: 2017-7-3 09:47

niwanmao 发表于 2014-6-6 19:48
同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对 ...

倪老师，我请问下电压跟补偿有什么关系呀？如果调FCS和SSC的电压，会对其他补偿有影响吗？

作者: niwanmao 时间: 2017-7-3 18:14

cdm874386070 发表于 2017-7-3 09:47
倪老师，我请问下电压跟补偿有什么关系呀？如果调FCS和SSC的电压，会对其他补偿有影响吗？ ...

FSC和SSC的电压不会影响，指的是荧光通道的电压会影响到补偿，所以存在一个最佳电压的问题，站内曾经发过关于电压优化的会议PPT照片以及相关资料。

作者: cdm874386070 时间: 2017-7-5 15:41

niwanmao 发表于 2017-7-3 18:14
FSC和SSC的电压不会影响，指的是荧光通道的电压会影响到补偿，所以存在一个最佳电压的问题，站内曾经发过 ...

谢谢，倪老师的耐心回答

作者: zj8237277 时间: 2017-7-28 16:37
倪老师，请帮解答。谢谢！

第3条、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检测时）。为何还可以用别的抗体来替换呢？而且是要选用更高表达量的呢？
第7条、阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。这如何去评判是否一致呢？

另外，荧光补偿的计算原理是？

作者: niwanmao 时间: 2017-7-30 09:47

zj8237277 发表于 2017-7-28 16:37
倪老师，请帮解答。谢谢！

第3条、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检 ...

第3条，为什么一定要选择高荧光强度的调节补偿，请参见近些日子发过的另一篇帖子：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6018-1-1.html

第7条，判断一致的标准就是两群细胞的Median值。

作者: zj8237277 时间: 2017-8-8 09:39
好的，谢谢！

作者: wenjuan1260 时间: 2017-12-8 08:00
老师你好比如我在阴性对照中把各个通道的电压都已调节好了我单染的两个管子是CD8-FITC和CD4-PE 那么我怎么调这两个通道的补偿不是电压确定好以后尽量不能调了吗那我调节补偿的时候具体应该在哪操作是在读完样品以后在compensation里面手动调吗谢谢

作者: jqr946 时间: 2019-7-18 14:22

niwanmao 发表于 2014-6-6 19:44
3、4本来就是一致的啊，就是应该尽可能用强度高的来调节补偿。

老师，我可以跨种属调补偿吗

作者: niwanmao 时间: 2019-7-19 10:31

jqr946 发表于 2019-7-18 14:22
老师，我可以跨种属调补偿吗

主要是细胞背景荧光会有差异，或许有差异，但是可做参考。

作者: jqr946 时间: 2019-7-20 15:15

niwanmao 发表于 2019-7-19 10:31
主要是细胞背景荧光会有差异，或许有差异，但是可做参考。

好的，谢谢！

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