流式检测巨噬细胞吞噬功能试验

zark_00

niwanmao 发表于 2012-2-20 09:17

                               
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第4页就是啊Phagocytosis Assay (Fig. 1B)。他这里是利用酵母素A来做的。

又详细看了下，确实是有，看来看文献真得认真啊~~~
查了Zymosan A BioParticles 的说明书，确实是做巨噬细胞吞噬的，但是说明书上没有详细流程，所以目前只能参照站长大人发的文献。真的很感谢。

叶绿素

zark_00 发表于 2012-2-20 21:36

                               
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小鼠腹腔巨噬细胞，原代.....

是的，小鼠腹腔的是原代的，也可以用细胞系做

叶绿素

niwanmao 发表于 2012-2-20 09:17

                               
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第4页就是啊Phagocytosis Assay (Fig. 1B)。他这里是利用酵母素A来做的。

倪老师，我只给别人测过，没有做相关实验啊

niwanmao

叶绿素 发表于 2012-2-20 22:27

                               
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倪老师，我只给别人测过，没有做相关实验啊

那人测出来的结果如何？如果好的话，有没有办法搞到他做的protocol，共享一下给大家：）

叶绿素

niwanmao 发表于 2012-2-21 09:04

                               
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那人测出来的结果如何？如果好的话，有没有办法搞到他做的protocol，共享一下给大家：） ...

测出来还可以吧，protocol要看看了，很久没联系了

叶绿素

zark_00 发表于 2012-2-20 21:40

                               
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又详细看了下，确实是有，看来看文献真得认真啊~~~
查了Zymosan A BioParticles 的说明书，确实是做巨噬 ...

你好，我这里的同学是测小鼠肺泡灌洗的，可以参考一下，感谢我那个热心的李同学，呵呵！
2.2.3动物处死与取样
将大鼠称重记录后，麻醉，采用股动脉放血处死，取血备用，解剖大鼠，结扎气管，用10mL生理盐水进行支气管肺泡灌洗，收集肺灌洗液（BALF）。在3000r/min，常温离心5分钟，收集肺灌洗细胞备用。上清液置1.5mL离心管中，于-80℃保存备用。
2.2.4原代肺泡巨噬细胞培养
将2.2.3收集的肺灌洗细胞，计数成2×10E6个/mL的RPMI-1640完全培养基(含2%胎牛血清)细胞悬液，接种到6孔板中，每孔2mL，置于37℃，5%CO2培养箱中，静置1h，待肺泡巨噬细胞贴壁后，用PBS缓冲液轻轻冲洗，更换新鲜培养基，每孔加1mL。肺泡巨噬细胞含量在95%以上，达到后续实验需求。
2.2.6原代巨噬细胞吞噬功能分析
参照细胞实验所采用的方法处理FITC标记的大肠杆菌和台盼蓝溶液备用。将2.2.4备好的6孔板取出，每孔加1mL菌液，于37℃、5%CO2培养箱中孵育2h。用PBS轻轻冲洗三次，向6孔板中加入500μL 0.02%的胰酶溶液，消化3min，制细胞悬液，于2500rpm，室温离心5min，弃上清。用PBS洗两次，在流式细胞仪检测前1min加入事先准备的台盼蓝溶液，分析细胞的吞噬功能，并给出阳性细胞所占比例(阳性细胞是指吞噬FITC标记大肠杆菌的巨噬细胞)。

（实际操作中未加台盼蓝）

zark_00

抱歉，忙了几天，没时间上来。
查询了更多的文献和试剂，准备买CD11b和分子探针的荧光标记大肠杆菌来试试，老板批了就买东西开始作。
谢谢楼上的分享，等我这边有进展了，我再来更新。

niwanmao

zark_00 发表于 2012-3-2 08:57

                               
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抱歉，忙了几天，没时间上来。
查询了更多的文献和试剂，准备买CD11b和分子探针的荧光标记大肠杆菌来试试， ...

欢迎下次来分享实验经验。

wll

流式上机前需要固定吗，不固定的话随着时间延长，荧光会不会被吞噬细胞吞噬掉？

niwanmao

wll 发表于 2021-12-13 14:23
流式上机前需要固定吗，不固定的话随着时间延长，荧光会不会被吞噬细胞吞噬掉？ ...

荧光主要是会被光淬灭，而不是被细胞吞噬，细胞要保持活力，是需要严格的生存环境的，如果在PBS中能保持那么强大的生命力，咱们培养细胞就容易喽：）