胞内细胞因子检测问题

woodking

最近在做流式，有些问题请教大家。我也是做胞内细胞因子的，一般做到破膜固定后放在冰箱内，第二天再继续胞内染色后上机检测，不知道这样有没有什么问题？还有BD的那个流程对于选择性固定后过一段时间再进行胞内染色的那段，没有提到再进行破膜，是不是漏掉了？

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 18:14

                               
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最近在做流式，有些问题请教大家。我也是做胞内细胞因子的，一般做到破膜固定后放在冰箱内，第二天再继续胞 ...

最近有研究生做IFN-γ、IL-17、IL-22，开始采用前一天晚上全部染好，放到第二天上机，结果发现细胞分群很差，表达不清，比例很低很低，于是后来建议其采用先固定，第二天进行破膜和胞内染色（约相隔12－15小时），发现效果比之前的方法好很多。所以你可以先固定好细胞，放在冰箱内，第二天大早来进行破膜和胞内染色。

你说的BD一个流程中没有提到破膜，是哪个？

woodking

我们这里只有下午才能上机，所以我们是第一天做到破膜固定后放到第二天中午继续胞内染色后上机。如果按倪老师的方法，先用什么固定呢？4%多聚甲醛吗？

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 21:30

                               
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我们这里只有下午才能上机，所以我们是第一天做到破膜固定后放到第二天中午继续胞内染色后上机。如果按倪老 ...

表面标记可以先染，然后用fix&Perm kit中的A液固定。

woodking

5. Alternative Fixation and Permeabilization Protocol
Cells can be fixed and stored to continue the intracellular staining at a later time.
a. Fixation and Storage of Cells
1. Resuspend cells in 100μl (or 1 ml/107 cells for bulk fixing) of a 4%
paraformaldehyde solution at 4°C for 10-20 minutes.
2. Wash cells 2× in Staining Buffer.
3. Resuspend cells in Staining Buffer for storing cells at 4°C for up to
72 hrs or in 90% FCS/10% DMSO for storing at -80°C for longer
periods of time.
b. Permeabilizing Fixed Cells.
1. For frozen cells, wash 2× to remove DMSO. For cells at 4°C,
pellet and remove staining buffer.
2. Resuspend cells in BD Perm/Wash™ buffer for 15 minutes.
3. Pellet by centrifugation.
4. Stain for intracellular cytokines.


在这里好像没提到继续要破膜

woodking

我是先染表面标记，然后破膜固定，再放在破膜buffer里到第二天继续染胞内细胞因子，因为以前也有人这样做的，结果还可以。但我的CD4就是标记不理想，不知道啥回事。

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 21:40

                               
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我是先染表面标记，然后破膜固定，再放在破膜buffer里到第二天继续染胞内细胞因子，因为以前也有人这样做的 ...

是先固定，再破膜，不叫“破膜固定”。
就这么操作。效果不错的。
CD4标记不理想可能是因为莫能霉素等刺激剂的影响，肯定没有未刺激的细胞分群清楚，但只要能分的开就行。

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 21:37

                               
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5. Alternative Fixation and Permeabilization Protocol
Cells can be fixed and stored to continue the  ...

这段中间我加粗的不就是破膜吗？
b. Permeabilizing Fixed Cells.
1. For frozen cells, wash 2× to remove DMSO. For cells at 4°C,
pellet and remove staining buffer.
2. Resuspend cells in BD Perm/Wash™ buffer for 15 minutes.
3. Pellet by centrifugation.
4. Stain for intracellular cytokines.

woodking

Fixation/Permeabilization solution，BD的东西不是一起的么？呵呵，谢谢了

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 21:45

                               
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Fixation/Permeabilization solution，BD的东西不是一起的么？呵呵，谢谢了

ebioscience、biolegend、invitrogen的都是分成两个组分，难道BD会例外？我记得BD做foxP3的破膜剂也是两个组分，是不是你记错了？