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人人为我,我为人人--荧光扣除对照(FMO)

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发表于 2015-1-19 21:01:02 | 显示全部楼层 |阅读模式

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你是不是碰到这种情况:做完一个多色流式实验,跑完所有对照,做完补偿,准备分析了,却发现不知道把门放在哪里?


是人都会犯错……

用流式细胞仪获取数据,会存在因为计数统计、数据处理和光电倍增处理等原因引起的测量误差。当进行补偿调节后,这些错误就会显示出来,你会看到调节完补偿后的数据呈弥散状态(见下图)。荧光强度越强,此类测量误差越明显。
compensation.gif


你应该意识到这些错误的存在,为了尽量减少数据弥散的出现,你可能需要设计一个更好的实验,或避免那些可能导致图形弥散的通道。不过,首先需要保证你使用了正确的对照,对数据进行了正确的解读。


荧光扣除对照(Fluorescence minus one controls,FMO)

FMO对照现在已普通应用于多色实验,而且是多色实验所必需的。FMO对照是指用同种细胞,染上去掉一种荧光素的其它所有荧光素。这样可以使各种荧光素对未标记通道的渗漏体现出来,使得你能够将门放在合适的位置,因此,是设门所必需的对照。

示例:

FMO

FMO


FMO-fig-2.jpg


上图显示了FITC和PE的染色,并给出了基于FMO正确区分CD4(PE+) T细胞群的设门方法。这些图显示出,即使你看不到PE-Cy5和PE-Cy7数据,但通道之间的补偿还是可以看出来这些荧光对PE通道的渗漏。所以,为了对PE+细胞进行正确设门,需要FMO对照,而不是空白对照。(数据来源:Mario Roederer, NIH Vaccine Centre.)


FMO真的必需吗?

是的,FMO是非常好的对照,你在投稿时会发现越来越多的评审要求你提供这些数据。然而,不是所有通道都需要。FMO对照只是在需要准确区分阳性、阴性时才是非常重要的,例如你要测定的抗原表达很弱、或者呈连续表达。
仔细观察你使用的通道,看看哪个通道需要FMO,也可以第一次把每个通道都应用一次FMO,然后分析后再决定哪个通道值得每次都使用FMO。


黄金原则:记得在实验中使用对照,并且记得每次实验都一起跑FMO对照。


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 楼主| 发表于 2015-12-11 17:36:28 | 显示全部楼层
luoying1983121 发表于 2015-12-11 16:29
老师,你好,我最近在做胞内因子IL10的染色,的确觉得设门有些困难。我开始用的是同型对照,按照我们实验室 ...

做胞内因子的FMO对照即可。如果分群不明显,并且背景较高,还是需要同型对照的。
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 楼主| 发表于 2015-3-30 14:55:51 | 显示全部楼层
culturelily 发表于 2015-3-30 14:44
请问,如果我用了FMO对照,就可以不用同型对照了

所谓同型对照,就是与目标抗体来源相同的免疫球蛋白,其作用就是为了排除该抗体非特异性结合引起的信号,无法排除其它因素(如荧光渗漏、信号干扰等)引起的非特异性荧光。而目前单克隆抗体的质量越来越好,所以单纯因为抗体非特异性结合引起的背景已经可以忽略,所以FMO的作用更加突出。

如果你是FMO+同型对照更理想,但一般认为是没有必要。
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发表于 2015-1-21 17:19:54 | 显示全部楼层
老师,如果我要测CD4+CD25+FOXP3+上面的tim3,要做几管啊?空白管,CD4单标管,CD4+CD25+FOXP3+管,CD4+CD25+FOXP3+tim3+管?要不要做CD4+CD25+双标管啊
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 楼主| 发表于 2015-1-21 20:58:37 | 显示全部楼层
Kimbryant 发表于 2015-1-21 17:19
老师,如果我要测CD4+CD25+FOXP3+上面的tim3,要做几管啊?空白管,CD4单标管,CD4+CD25+FOXP3+管,CD4+CD25 ...

你要圈foxP3阳性的细胞,然后再要分析这类细胞中的TIM3,所以按照道理CD4+CD25+是需要的。但实际上foxP3目前大多数都是可以分群清楚的,所以不做问题也不大。
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发表于 2015-3-30 14:44:31 | 显示全部楼层
请问,如果我用了FMO对照,就可以不用同型对照了
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发表于 2015-3-30 21:58:16 | 显示全部楼层
第一个图里面的C和B的门是根据什么圈出来的?高度如何确定?
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 楼主| 发表于 2015-3-31 10:57:14 | 显示全部楼层
culturelily 发表于 2015-3-30 21:58
第一个图里面的C和B的门是根据什么圈出来的?高度如何确定?

C门是阴性区域门,B是最高表达的那群阳性细胞,至于高度,问题不是很大。上面示例中因为C门上面有少量非特异性染色,所以避开了点。
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发表于 2015-5-11 22:55:37 | 显示全部楼层
楼主您好,请问我如果用单染管 是否也可以起到FMO对照的效果?我的理解是每个单染管也可以看到染色荧光在其他通道的渗漏情况,不知与您的FMO染色方式有何不同?敬请指教!
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发表于 2015-5-11 23:48:06 | 显示全部楼层
倪老师我有个问题:FMO对照可以用beads做吗?
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 楼主| 发表于 2015-5-12 15:40:15 | 显示全部楼层
zpmsimpy 发表于 2015-5-11 22:55
楼主您好,请问我如果用单染管 是否也可以起到FMO对照的效果?我的理解是每个单染管也可以看到染色荧光在其 ...

单染看的是这个通道漏到其它通道的荧光有多少,而FMO则看的是其它通道漏到这个通道的荧光有多少,恰恰相反的作用。
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