小鼠骨髓B细胞流式

niwanmao

十二郎 发表于 2015-5-7 09:00
我也不知道裂解液到底有没有问题，就是换用氯化铵裂解液后冰上裂解2分钟，B220能有高低表达，IgM也能标记 ...

基本上所有文章都是先孵育再裂解啊。

十二郎

ddn111 发表于 2015-5-6 20:55
商品化裂解液要了解配方才能在标记前裂解，像BD的裂解液就含有固定成分，所以标准流程都是先标记后裂解！ ...

@niwanmao 这个是流式中文网上的一篇文献，也是说是先裂红再孵育抗体的啊。有先孵育抗体再裂红的文献不，交流一下

https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=ODAxMnw0OTY0YzdkYnwxNzE1MzE5MTA0fDB8

niwanmao

十二郎 发表于 2015-5-12 20:49
@niwanmao 这个是流式中文网上的一篇文献，也是说是先裂红再孵育抗体的啊。有先孵育抗体再裂红的文献不， ...

你是指这句话吧：
This will invariably include some combination of density gradientcentrifugation, positive or negative selection procedure (panning, complement-mediated celllysis) straining through nylon-mesh and/or red-cell lysis where necessary.

看到最后一个where necessary了吗？此外，这几个步骤的顺序看到了吗？我们不能主次颠倒啊，当在常规先染色后裂解测不好的情况下，只好采用梯度离心或阳性/阴性分选纯化细胞，必要时配合尼龙网过滤和/或红细胞裂解。

至少，目前国内外的共识都是先染色后裂解。

十二郎

niwanmao 发表于 2015-5-12 21:35
你是指这句话吧：
This will invariably include some combination of density gradientcentrifugation,  ...

好的  倪老师  我再查一下相关文献

niwanmao

十二郎 发表于 2015-5-12 21:47
好的  倪老师  我再查一下相关文献

其实吧，我觉得你为什么一定要纠结这个步骤顺序呢？跟着主流走吧

十二郎

niwanmao 发表于 2015-5-12 22:04
其实吧，我觉得你为什么一定要纠结这个步骤顺序呢？跟着主流走吧

哈哈，谢谢倪老师，主要是我以前的流式技术是师姐带的，学了点皮毛。就是用以前先裂红后染色的步骤，但是我发现就是洗3遍的时候，IgM的染色也并不是很稳定。所以我在想是不是这个IgM 染色效果和裂红的顺序有关。

十二郎

十二郎 发表于 2015-5-12 22:37
哈哈，谢谢倪老师，主要是我以前的流式技术是师姐带的，学了点皮毛。就是用以前先裂红后染色的步骤，但是 ...

多次摸索后  此问题已顺利解决  细胞分群良好  染色效果良好

niwanmao

十二郎 发表于 2015-7-15 11:20
多次摸索后  此问题已顺利解决  细胞分群良好  染色效果良好

最后怎么样？

十二郎

niwanmao 发表于 2015-7-15 16:44
最后怎么样？

说实话我也不知道到底是不是商品化红细胞裂解液的问题。反正自己配的氯化铵裂解液后，不管是先裂红后染色，还是先染色后裂红，骨髓细胞明显有淋巴、单核和粒细胞三群，外周血的三群更为明显，只是外周血只做过一次，IgM当时没有染上，我猜测应该是染色之前没有洗3遍的原因，脾脏的三群不是很明显。我分别用先裂红后染色和先染色后裂红两种方法对比，做各自的单标进行4色标记，然后用对方的单染做4色标记，结果显示分群比例几乎无差异。

niwanmao

十二郎 发表于 2015-7-16 09:16
说实话我也不知道到底是不是商品化红细胞裂解液的问题。反正自己配的氯化铵裂解液后，不管是先裂红后染色 ...

一般自配氯化铵裂解液都是不错的，商品化大多只是增加了固定剂。