foxp3染色问题求助

大头

librahui 发表于 2016-1-12 16:43
亲 你是PBMC做的，还是全血做的，我是全血做的，做不出来

我们是脾脏和淋巴结，效果很好
全血裂红后做的，FOXP3能染上，但CD25染得效果不是很好

librahui

大头 发表于 2016-1-13 08:41
我们是脾脏和淋巴结，效果很好
全血裂红后做的，FOXP3能染上，但CD25染得效果不是很好 ...

那亲你用的溶血素是哪个厂家的，我用的是BD的，ebi的技术说含固定成分，让我换成不含甲醛的溶血素，现在就是在排除问题，好纠结

大头

librahui 发表于 2016-1-13 11:08
那亲你用的溶血素是哪个厂家的，我用的是BD的，ebi的技术说含固定成分，让我换成不含甲醛的溶血素，现在 ...

我们就是自己配的红细胞裂解液，就是网上普通的配方

stem_cells

librahui 发表于 2016-1-13 07:48
恩恩 谢谢老师，现在正在和试剂商沟通

做Foxp3可以尝试一下分PBMC做，我们试过全血做不出来，但是分PBMC以后可以染出来。

奇天

那种FIX和perm放在一起的试剂不好用，也不知道是FIX和perm放在一起的原因，还是之后步骤的perm不好用。后来我换了FIX和perm分开的试剂盒，这个就很好用，避嫌做广告，具体的自己搜吧

niwanmao

奇天 发表于 2016-8-30 15:40
那种FIX和perm放在一起的试剂不好用，也不知道是FIX和perm放在一起的原因，还是之后步骤的perm不好用。后来 ...

应该不是这个原因，可能跟破膜成份有关，有些破膜剂只能破胞膜，而foxP3需要破核膜。

奇天

niwanmao 发表于 2016-8-30 17:54
应该不是这个原因，可能跟破膜成份有关，有些破膜剂只能破胞膜，而foxP3需要破核膜。 ...

是我理解偏了
FIX和prem放在一起的那种试剂盒说明书破膜时间短，反正不是过夜，对比了一下，过夜的方式是对的，说明书是错的，还有一处错误：加入Foxp3孵育后进行清洗时用的是staining buffer，而不是用perm洗。
我用的FIX和perm分开的那种是破细胞膜的，如果先把细胞冻存，染色效果就会好些，应该是DMSO起到了破膜的作用。我最近把FIX和perm一起加入过夜，发现不冻存细胞也能染上颜色，效果会好很多，这是在流式中文网得到的启示。请问倪老师，1、FOX3是不是连续表达；2：这两种perm的成分一样吗，如果不一样，是不是能破核膜的prem更强一些。

niwanmao

奇天 发表于 2016-9-22 09:19
是我理解偏了
FIX和prem放在一起的那种试剂盒说明书破膜时间短，反正不是过夜，对比了一下，过夜的方式是 ...

我不知道你用的是什么品牌，什么批号的试剂盒。至于你这里说的冻存后染的好，这应该不会是DMSO作用，DMSO是保护细胞的，而是冻存本身的作用，冻存本身对细胞膜有影响。

你问的foxP3是否连续表达指什么意思？指染色的时候他们继续还在表达出来？
不同商品的破膜剂成份可能一样，也可能不一样，看厂家那边能否查到成份了。

奇天

倪老师帮看看这个说明书是不是有问题


关于Foxp3的连续表达：我的意思是Foxp3在分群的时候是不是很清晰，是不是分的很开，如果有Foxp3和CD25双阳的标准图，发个看看呗

她说加油JJ

你好，我想请教您做TH17的具体方法，我是提PBMC后培养刺激，染CD4 IL-17效果一直不理想，CD4分群不好，IL-17没表达，各种问题。想咨询您一些TH17具体的方法步骤，谢谢。你是CD3CD8标记还是CD4啊？