FITC单染补偿？火箭峰是什么？

椴树

上皮贴壁细胞，很难消化，且细胞总是从周围向中间脱落，并不整个均匀脱落。BD的 annexin V-FITC/PI 双染检测凋亡
操作步骤：
所有操作RT，PBS洗2次，加400ulPBS，细胞刮刮下细胞，200g 4min，弃上清，加100ul binding buffer 成团现象严重因此200ul枪头调到90ul反复吹打100次，加染料，RT 20min后，补加300ul binding buffer过40um筛网，上机，细胞密度很低。
问题：
1：FITC单染调节补偿时，补偿值调到29 依然不见分群，是不是补偿值调得还不够高？ 是由于PI的荧光强度跟FITC的荧光强度差太大所致么？
2：什么是火箭峰？我这些图里有火箭峰么？怎么区分火箭峰是由于补偿不正确还是细胞活力不好导致的呢？火箭峰是不是只出现在活细胞上流式的实验过程中，固定细胞就不存在呢？火箭峰出现的原理是什么呢？
3：PI的峰型图上阳性主峰右边还有一个小峰，这个小峰是什么？

诚心跪求ORZ高手解答

niwanmao

首先要说的是，贴壁细胞确实不适合做ANNEXIN V，基本上做不出好结果。可以考虑做细胞周期。

1、不是补偿值不够，而是非特异性染色太厉害，可以再适当调高FITC的电压。
2、火箭峰多指位于对角线的非特异性染色，一般是由细胞活力差导致，补偿不正确的类似火箭峰但是可以通过补偿调下去，而死细胞导致的补偿调得再高也很难下去。
3、ANNEXIN V-PI测凋亡只需用散点图分析即可，不要用直方图，你这几个散点图分群都还可以，但是细胞死的太多。

椴树

niwanmao 发表于 2013-5-7 19:08

                               
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首先要说的是，贴壁细胞确实不适合做ANNEXIN V，基本上做不出好结果。可以考虑做细胞周期。

1、不是补偿值 ...

谢谢老师 就是说 其实 我每个图里 都是有火箭峰的，细胞活力差导致的非特异染色？是指细胞死了之后相对活细胞来说 比较容易染上annexinV或者其他别的什么抗体么？那么怎么排除非特异染色呢 除了操作上减少细胞死亡外？是不是可以通过封闭呢？为什么非特异染色会导致分布在对角线上呢？就是它两个通道的荧光值相等？是不是因为说如果一个FITC标记抗体和一个R-PE标记的另外抗体，同时染一种细胞的话，活细胞的话2种目的抗原不同所以同时标上的FITC和R-PE的量也不同，但是如果是死细胞非特异染色的话，细胞标记上FITC和R-PE的机会是等同的所以2个通道的荧光值一样？  我总觉得我理解错了 因为这样的话，那PI和annexin V-FITC的染法又是不一样的，一个染膜上的PS，一个得进细胞染核，就算细胞死了 概率也不等的啊，麻烦老师指正

niwanmao

椴树 发表于 2013-5-7 21:34

                               
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谢谢老师 就是说 其实 我每个图里 都是有火箭峰的，细胞活力差导致的非特异染色？是指细胞死了之后相对活 ...

你想多了，呵呵。


建议参考一下这个帖子：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2156-1-1.html

椴树

niwanmao 发表于 2013-5-7 22:31

                               
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你想多了，呵呵。

好吧 谢谢老师

haven_t

椴树 发表于 2013-5-7 21:34

                               
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谢谢老师 就是说 其实 我每个图里 都是有火箭峰的，细胞活力差导致的非特异染色？是指细胞死了之后相对活 ...

可能对于非特异性染色的概念大家都不一样，我个人觉得成为非特异荧光可能恰当一点，因为blank里面也会出现这种分布。我猜测是一些细胞里面的某些物质（例如代谢产物等）产生了波长跨度较大的发射光，可能跨越几个荧光通道的波长，所以通道间呈现明显的线性关系，这个是无法用补偿来消弭的，首先是发射光进入每个通道的强度相当，真的让你调到适当的位置补偿也很大，而且就算你真的调好了，但我们实验用的荧光素波长跨度会比较小，这个补偿值对于你实验试剂的荧光素明显偏大，造成阳性细胞压在坐标轴上，图形被扭曲。

这种情况我建议不用太在意，如果真的影响到分析，建议换APC检测，我感觉这种荧光对APC通道影响较少，你可以试一下看看空白APC vs PE 的图，看看这种情况是不是没这么严重，如果是的就换APC 标记的AV。

niwanmao

haven_t 发表于 2013-5-7 23:07

                               
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可能对于非特异性染色的概念大家都不一样，我个人觉得成为非特异荧光可能恰当一点，因为blank里面也会出 ...

你说的是其中一种情况，另外还有一种由于细胞状态差或死亡，导致结合无特异性，那种情况所有通道的荧光均可结合，我碰到几次。

haven_t

niwanmao 发表于 2013-5-8 11:32

                               
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你说的是其中一种情况，另外还有一种由于细胞状态差或死亡，导致结合无特异性，那种情况所有通道的荧光均 ...

是的，但是这是做AV-PI哦，所以很肯定第一管也就是第一张图是空白不是同型，也就是什么都不加，这是细胞自然的状态。

samly0

我觉得第一张虽然是空白，什么都不加，但也不能完全代表细胞自然状态，因为贴壁细胞，不管是消化下来或者用细胞刮子刮下来，制成悬液上机检测的过程，总会难以避免机械损伤，总会有状态差或死亡的细胞的，是多是少多少而已。

ddn111

１、做凋亡中的空白细胞其实没多大用处，还是要用ＦＭＯ，也就是单染做对照！蛋白标记上荧光后和荧光抗体标记不大一样，会导致本底信号偏大点。从几个图的阴性峰位置就可以看到。
２、ＦＩＴＣ单染样品图中，不是火箭峰，而是补偿没调到位！可把数据发上来验证下的。
３、样品处理后ＦＩＴＣ信号没有分开，可用ＢＩＮＤＩＮＧ　ＢＵＦＦＥＲ（先不加Ｃa）代替ＰＢＳ做为洗液。
３、ＰＩ分离度很好，没补偿好貌似对结果影响不大！